Способ определения повреждений криоконсервированных клеток крови

БРЕТЕН ЕЛЬСТВ ЛЕНИЯ ПОВРЕЖЦЕЫХ КЛЕТОК КР че личаю целью по ия, забор овательно ьвеооразличных периферии ннону ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМ ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ ОПИСАНИЕМ АВТОРСКОМУ СВИД(7 1) Институт проблем криобиологиии криомедицины АН УССР(54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕ НИИ КРИОКОНСЕРВИРОВАНН ВИ путем взятия пробы хранности клеток, о т щ и й с я тем, что, с ния точности определен бы осуществляют послед мере размораживания в нах по направлению от центру.Изобретение относится к криобиологии и может быть использовано при низкотемпературном консервировании клеточных суспензий.Целью изобретения является повы шение точности определения,На чертеже изображена схема выполнения предложенного способа.В стандартный металлический герметичный контейнер 1 после его запол 10 нения суспензией клеток через специальные герметичные вводы 2, располо-. женные вдоль продольной оси контейнера, симметрично его центру, в выбранные зоны контейнера вводят иглы 15 3 заборного устройства. После этого суспензию замораживают. При отогреве замороженной суспензии в полости мерной бюретки 4 заборного устройства создается пониженное давление. В 20 тот момент, когда суспензия на уровне конца заборной иглы 3 переходит из твердого состояния в жидкое за счет разности давлений в контейнере и бюретке, происходит ее всасывание 25 в полость бюретки. Объем взятой пробы контролируют визуально.После набора необходимого количества размороженной суспензии из соответствующей зоны контейнера дав- З 0 ление в мерной бюретке устанавливается равным атмосферному. После взятия проб из выбранных зон объема клеточной суспензии берут общую пробу после полного размораживания всего объема. Пробы анализируют и определяют повреждения клеток в каждой из зон и во всем объеме.Всю процедуру повторяют несколько раз до установления с уровнем досто верности не ниже 0,9 факта наличия или отсутствия различий в повреждении клеток в пробах, полученных из различных зон контейнера и всего размороженного объема в целом, , 45П р и м е р 1. Металлический контейнер 1 объемом 150 мл и расстоянием между стенками 6 мм заполнили эритромассой и через герметичные вводы 2 на расстоянии 50 мм друг от друга вдоль продольной оси "симметрично центру на глубину 1 и 2 мм ввели иглы 3 заборного устройства диаметром 0,3 мм и длиной 25 мм, после чего суспензию заморозили погружением 55 контейнера в жидкий азот. На этапе отогрева контейнер погрузили в водяную баню с температурой +42 С, контейнер при этом непрерывно покачивали для обеспечения перемешиванияразмороженной эритромассы,После открытия кранов 5 и 6 заборного устройства полость мерной бюретки 4 сообщалась с разреженным объемом, давление в котором было на уровне 0,8 атм. В тот момент, когда науровне конца заборной иглы 3 замороженная суспензия эритроцитов перешлаиз твердого состояния в жидкое, черезиглу 3 за счет разности давленийпроизошло всасывание размороженнойсуспензии эритроцитов, После набора1 мл размороженной суспензии из соответствующих зон (с глубины 1 мм и2 мм) краном 5 перекрыли доступ суспензии в бюретку 4, а краном 6 выравнили давление в бюретке 4 с атмосферным, Разрежение в 0,2 атм не приводило к дополнительному повреждениюклеток.После размораживания всего объемасуспензии осуществили набор третьейпробы из всего объема контейнера,Всего было 6 повторностей.Повреждение клеток суспензии эритроцитов определяли по количествусвободного гемоглобина в надосадкепроб, Средние данные четырех опытовприведены в таблице.П р и м е р 2. Повреждения эритро.цитов определяли в разных зонах контейнера объемом 300 мм (9 опытов).Способ осуществляли аналогично примеру 1.Полученные данные приведеныв таблице.Содержание свободного гемоглобинав пробах из различных зон контейнераи из объема вцелом приведено втаблице,Для контейнера объемом 150 мл полученные средние величины уровня сво" бодного гемоглобина в надосадке проб, 1полученных иэ первой зоны, второй зоны и из контейнера вцелом, достоверно отличаются между собой с уровнем значимости не ниже 0,9. Из таблицы видно, что в контейнере объемом 150 мл гемолиз эритроцитов вначале растет от 85 мгХ вблизи стенки в первой зоне до 1147 во второй зоне, а затем резко падает, так как если бы повреждения эритроцитов на глубине более 2 мм оставались на уровне 114 мг 7. или возрастали, общий гемолиз в контейнере не мог умЬньшитьсяРедак орректор С.Шекмар акаэ 39 47 Тираж 897 НИИПИ Государственног по делам изобретений 13035,Москва, Ж,Подписноекомитета СССРоткрытийушская наб., д. 4 Патент", г,Ужгород, ул.Проектная, 4 илиал до 49 мгХ, Так как после глубины 2 мм произошло значительное падение гемолиэа, то в центральной зоне контейнера должна располагаться область, в которой гемолиэ эритроцитов мини мален или близок к нулю.Для контейнера объемом 300 мл полученные средние значения гемолиэа эритроцитов в первой зоне на глубине 1 мм достоверно отличаются от гемоли за во второй зоне, и средние значения гемолиэа во второй зоне - от значений гемолиза в контейнере вцелом. Во всех случаях уровень значимости 0,9. При имеющемся разбросе отличия 13 в показателях гемолиза в первой зоне и контейнере вцелом незначнмы. Это говорит о том, что в контейнере объемом 300 мл показатель гемолиза во всем объеме находится на уровне 20 гемолиза в первой зоне, несмотря на то что во второй зоне гемолиз эри"У троцитов заметно вьппе, Эти данные свидетельствуют о том, что в контейнере объемом 300 мл гемолиз также 2 В пол растет по направлению от стенки кон- н, тейнера к центру от 100 до 188 мгй,Ъ а затем за счет минимального гемолиэа в третьей зоне возвращается в контейнер вцелом к показателям гемо- За лиза, имеющим место вблизи стенки.