Способ определения гистидина

ссср ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕ К АВТОРСКОМУ СБИДЕТЕЛЬСТ дписнт группаа он ЕЛЕБИЯ ГИС 4915 а/23 в Комите овете й 1 инистров СПОСО по делам изобретепп"ССР Заявлено 30 декабря 1959 г. заи открытий при.петене изобретений 18 за 1960 г. пуоликоваио Методы открытия и определения микроколичеств гистидина представляют большой интерес для врачей, биохимиков и физиологов, изучающих обменные процессы растительных и жизотных организмов, в которых участвует данная аминокислота. Важность более полного изучения ее функций видна хотя бы из того, что она генетически близка к биогенному аминогистамину. Последний, по-видимому, играет весьма существенную роль в развитии ряда тяжелых заболеваний человека и кивотных и, в частности, болезни, вызванной действием ионизирующей радиации,Предлагаемый спдособ определения гистидина бромированием и конденсацией его, заключается в том, что для повышения чувствительности и избирательности способа, продукт бромирования конденсируют с циктическими соединениями, содержащими группы СН 2 - СО, например, с димедоном или фенилметилпиразолоном. Образозавшийся нерастворимый в воде на холоду краситель экстрагируют орга:-плоским расворителем, например смесью этил- и изоамилацетатов и определяют оптическую плотность раствора красителя, пропорциональную содержанию гистидина в исходном образце.Наиболее существенными критериями аналитического мегода являются предел его чувствительности и степень изоирательностн. Опыты позво.(яют утверждать, что предложенная реакция более чувствительна, чем все известные до сих пор цветные тесты на гистидин, Так. при анализе чистых водных растворов аминокислоты окраска в органическом растворителе появлялась при 2 - 3 микрограммах кислоты в 5,3 лл водной фазы, т. е. при разведении около 1: 2.500.000.Изоирательность реакции проверена отдельными опытами с биогенными или близкими к ним органическими соединениями. Ни одно из 100 проверенных веществ не показывало идентичной цветной реакции.Димедоновая реакция была использована для определения гистидина в сложных для анализа объектах, как, например, в моче Предлагаемый спосоо ускоряет проведение анализа данной аминокислоты и улучшает при этом избирательность и чувствительность реакций, Он131962 Предм ет изобр етенияСпособ определения гистидина при помощи его бромирования и конденсации, о тл и ча ю ш и йс я тем, что, с целью повышения чувствительности и избирательности способа, продукт бромирования конденсируют с циклическими соединениями, содержащими группы СН - СО, например, с димедоном или фенилметилпиразолоном, образовавшийся нерастзоримый в воде на холоду краситель экстрагируют органическим растворителем, например смесью этил- и изоамилацетатов, и определяют оптическую плотность раствора красителя, пропорциональную содержанию гистидита в образце. Редактор С, АБарсуков Техред А, А. Камышникова Корректор Л. Е. Чекунова Формат бум. 70 Х 08/Объем 0,17 п. л. Тираж 800 Цена 25 коп.; с .1-61 г. - 3 коп. ЦБТИ при Комитете по делам изобретений и открытий прн Совете Министров СССР Москва, Центр, М. Черкасский пер д. 2/6Попп. к печ, 5.Х 1-60 гЗак. 9479 Типографии ЦБТИ Комитета по делам изобретений н открытий при Совете Министров СССР, Москва, Петровка, 14.2 доступнее многих других способов и не требует уникальных или дорогостоящих реактивов, Расход реактивов на анализ неоольшой, что имеет важное значение при серийных опытах,П р им е р. Определение гистидина в биогенных субстратах, А. Методика определения гистидина и получение данных для построения калибровочного графика.Свежепритотовленные водные растворы, содержащие в 4 мл от 2 до 12 лкг гистидина, при температуре около 16 бромируют смесью, состоящей из 0,1 мл раствора КВг (24 г КВг в 100 лл воды), 0,1 лл раствора КВгОз (4 г КВ;Оа в 100 лил воды) и 0,5 юг 5 н НзРО 4. Через 1 О мин к реакционной смеси прибавляют 0,3 мл насыщенного раствора НСОО 1 ча. 2 НО и 1,0 лл насыщенного на холоду и профильтрованного раствора димедона (демитилдигидрорезорцина). Полученную реакционную смесь паггевают 10 лин при 90 и быстро охлаждают водой до комнатгной температуры. Образовавшийся окрашенный продукт извлекают 5 лл смеси равных объемов этилацетата и изоамилацетата и через 10 лик определяют оптическую плотность полученного экстракта,При содержании в 4 Ал исходного раствора 2,5; 5,0; 7,4; 9,8 и 12,4 мкг гистидина оптические плотности экстракта, полученного описанным способом, при измерении на фотоэлектроколориметре ФЭК-Н, составляют соответственно: 0,052; 0,114; 0,184; 0,229 и 0,264, т. е, нарастание оптических плотностей практически пропорционально увеличению концентрации гистидина в исходных растворах и соответствующий. калибровочный .график дочти приближается к прямой.Б, По описанной методике определяют содержание гистидица в обычной моче а человека и в той же моче Ь, в которую дополнительно введено известное количество гистидина. а оВзято неразбавленной мочи мл) 005 0 Ь Объем пробы после разбавления водой (мл) 4,0 4,0 Введено в пробу чистого гистидина "мкг) - 3,1 Найдено гистидина в моче лкг) 6,2 9,1 Найдено в моче введенного гистидина 1 мкг) - 2,9 % введенного гистидина, определенный по анализу - 93,5 Результаты аналитических определений подтверждают правильность описанной методики определения гистидина.