Способ получения авирулентного иммуносорбента для выявления постинфекционных антител при ретроспективной диагностике ящура

Номер патента: 1835658

Авторы: Жучкова, Романова, Мезвришвили, Шажко, Рахманов

Скачать ZIP архив.

Текст

12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯторскому свидетельст 2 19.03.9 и Л.Б Романо г .) о выявлению, ифичности и ю антител к ви животных. АВИРУЛЕНА ДЛЯ ВЫЯВЕКЦИОННЫХ ТИВНОЙ ДИу вирусологив бнотехнолоя изготовлениСущность споКомитет Российской Федерации по патентам и товарным знакам(56) Методические указания иидентификации типовой спецколичественному определенивирусу ящура в сыворотке кроГУВ МСХ СССР. 10.02.83,(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯТНОГО ИММУНОСОРБЕНТЛЕНИЯ ПОСТИНФАНТИТЕЛ ПРИ РЕТРОСПЕКАГНОСТИКЕ ЯЩУРА(57) Изобретение относитсяи может быть использованогической промышленности длсредств диагностики ящура.(51) б А 61 К 39(135,С 01 1 Ч 33/531 С 12 И 7/05 соба заключается в том, что моцослойцую культуру клеток заражают вирусом ящура и после появления признаков цитопатнчсского действия размножающегося вируса освобождают от ростовой среды. Моцослой снимают смесью равных объемов трипсцца и версена. Из осадка полученного цецтрцфугнрованием, после разбавления в 10 раз раствором Хенкса готовят мазки на предметах стеклах. Мазки подсушивают, фиксируют ацетоном и обрабатывают 0,01 0,001 Н, раствором соляной кислоты в течение 3 - 5 мин для инактивации ицтрацеллюлярного вируса, Кислоту нейтрализуют раствором фосфатного буфера и промывают дистиллированной водой, Полученные препараты используют в качестве иммуносорбентов для постановки реакции при ретроспективной диагностики ящура. 4 табл, 1835658Изобретение относится к вирусологии, точнее к способам получения иммуносорбентов на основе инактивированного вируса ящура, находящегося в цитоплазме инфицированных клеток, путем их химиче ской обработки, и может быть использовано в научно-исследовательской работе и биологической промышленности при изготовлении средств диагностики ящура.Целью изобретения является упроще ние и сокращение времени технологического процесса при сохранении исходной серологической активности и стабильности иммуносорбента.Поставленная цель достигается тем, что 15 в известном способе получения авирулентного иммуносорбента для выявления постинфекционных антител при ретроспективной диагностики ящура, вкючающем получение инфицированного виру сом препарата клеток, его фиксацию на подложке и последующую инактивацию интрацеллюлярного вируса, в соответствии с изобретением для инактивации интрацеллюлярного вируса фиксированный препа рат клеток смачивают 0,01-0,001 н, раствором соляной кислоты в течение 3-5 мин.П р и м е р 1. Матрасы, содержащие монослойную культуру клеток ВНК, за раженную вирусом ящура типа А 22 со множественностью инфицирования 0,1 ТОДБО/клеток, после появления признаков цитопатического действия размножающегося вируса (округление и увеличение опти ческой плотности у 10-70 клеток . монослоя) освобождают от ростовой среды.Монослой снимают смесью равных объ-.емов 0,5 -ного раствора трипсина и 0,25 раствора версена, Из осадка, полученного 40 центрифугированием в течение 30 мин при 1000 об/мин, готовят после разбавления в 10 раз раствором Хенкса мазки на предметных стеклах, помещая на каждое из них по 2 - 3 капли клеточной суспенэии диаметром 45 0,5 - 0,7 см, Стекла с клеточными препаратами подсушивают при комнатной температуре или в термостате при 37 С в течение 45 мин, Затем препараты клеток фиксируют 20 мин охлажденным (от+4 до -190 С) безвод ным ацетоном. После подсушивания фиксированные препараты клеток обрабатывают0,01 н. раствором соляной кислоты в течение 5 мин при инактивации интрацеллюлярного вируса, Через. 5 мин кислоту .55нейтрализуют 0,15 М раствором фосфатного буфера (рН 7,6) в течение 10 мин, затем промывают дистиллированной водой, 3-5 препарата используют для контроля на остаточный вирус, а остальные препараты используютв качестве иммуносорбентов для постановки НРИф при ретроспективной диагностике ящура, Препараты хранят при температуре ниже +4 С в течение 1-2 мес (ср.ок наблюения).П р и м е р 2. Операции по получению препаратов иммуносорбента проводят так, как описано в примере 1. Отличие состоит в том, что процесс инактивации проводят 0,01 н. раствором соляной кислоты в течение 3-х мин.П р и м е р 3. Операции по получению препаратов иммуносорента проводят так, как описано в примерах 1 или 2. Отличие состоит в том, что в качестве системы культивирования вируса используют клетки СП.П р и м е р 4. Операции по получению препаратов иммуносорбента проводят так, как описано в примерах 1 или 2. Отличие состоит в том, что в качестве системы культивирования вируса используют клетки СП.Эффективность инактивации интрацеллюлярного вируса соляной кислотой проверяли на препаратах вируса ящура, полученного на разных системах культивирования. Препараты представляли собой предметные стекла, на которые наносили по 2-3 капли суспензии монослой культуры клеток ВНК, БП и 4 СП, снятых со стенок культуральных сосудов, ЦПД должно захва-тывать не менее 10 - 15 и не более 60-70 клеток, После подсушивания на воздухе при комнатной температуре или при+37 С в течение 30-60 мин сразу же или.возможно на другой день препараты фиксировали охлажденным от+4 до -10 С безводным ацетоном в течение 20 мин, а затем подсушивали и обрабатывали 0,1 - 0,0001 н. растворами соляной кислоты. Инактивацию проводили при комнатной температуре и при 37 С в течение 1-10 мин. На обусловленный схемой опыта момент препараты промывали 0,15 М фосфатным буфером, а затем дистиллированной водой, подсушивали и проверяли остаточную вирулентность титрованием в исходной культуре клеток. Для этого мазки соскабливали с помощью скальпеля, собирали отделившиеся клетки в фарфоровую ступку, тщательно растирали, заливали 1 мл питательной среды для культивирования клеток, проаораживали при-40 С в течение часа и осветляли 15-минутным центрифугированием при 3000 об/мин, Результаты титрования выражали показателем К 5 о. Этот показатель характеризует концентрацию инактиванта, защищающую 50 инокулированных культур от поражения остаточным вирусом, Его вычисляли по формуле КерберАшмарина, Опыты показали, что через 3-5 мин значение К 50 составляет 0,0001 н, неэа 1835658висимо от температуры процесса, а полную инактивацию вируса в зафиксированных клетках обуславливали за зто время все концентрации соляной кислоты от 0,001 и выше.Использование полученных инактивированных иммуносорбентов для постановки Н РИФ показало, что интенсивность специфического свечения инфицированных вирусом клеток после инактивации 0,001 н, соляной кислотой ке уступает свечению клеток, инактивированных согласно прототипу. При более высоких концентрациях соляной кислоты отмечалось ослабление яркости свечения в связи с выраженным повреждением структуры зафиксированных клеток.Результаты исследований инактивированных препаратов культуры клеток ВНКи СП на остаточный вирус приведены в табл 1.Иэ данных, приведенных в табл.1, видно, что 0,001 н. раствор соляной кислоты надежно инактивирует вирус ящура в инфицированных культурах клеток в течение 3 мин как при 37 оС, так и при комнатной температуре, Инактивированные в соляной кислоте препараты не уступают по активнасти в НРИФ препаратам, полученным по способу-прототипу. Аналогичные результаты получены и при инактивации вируса в клетках БП.Результаты оценки эффективности инактивации интрацеллюлярного вируса предлагаемым способом в сравнении с прототипом приведены в табл.2. Из данных табл.2 видно, что предлагаемый способ получения иммуносорбента для НРИФ по эффективности инактивации вируса ящура, находящегося в цитоплаэме инфицированных клеток, не уступает способу-прототипу, Интенсивнсоть НРИФ на препаратах, полученных сравниваемыми способами, оказалось адекватной. В то же время предлагаемый способ позволил продолжительность процесса инактивации сократить в 1920 раэ по сравнению с прототипом.Дополнительную оценку качества иммуносорбентов, полученных сравниваемыми5 способами, провели в опытах по выявлениюпостинфекционных антител в сывороткекрови крупного рогатого скота с разным иммунологическим статусом. При этом былииспользованы пробы сыворотки от живо 10 тных-реконвалесцентов, поствакцикалькыеи отрицательные сыворотки от интактныхживотных,Результаты исследований приведекы втабл.З.15 Данные, приведенные в табл.З, свидетельствуют о том, что как количеству положительных проб, так и по тритрам антителвыявляемых в РИФ, сравниваемые иммукосорбенты дали сопоствимые результаты,20 Проведены исследования, характеризующие стабильность полученного предлагаемым способом иммуносорбента при егодлительном хранении в сравнении с препаратами, полученными способом-прототи 25 пом,Результаты исследований представлены в табл.4,Из данных табл.4 видно, что по срокамгодности для постановки РИФ иммуносор 30 бент, полученный предлагаемым способом,не уступает прототипному и может быть использван в диагностических целях в течекиене менее 3 мес.Предлагаемый способ обладает по срав 35 нению с прототипом следующими преимуществами:обеспечивает получение полностьюавирулентного в ветеринарно-санитарномотношении препарата, пригодного для ши 40 рокого практического применения;продолжительность процесса инактивации сократилась в 1920 раз при сохраненииисходной серологической активности и стабильности иммуносорбента;45 достигается упрощение техкологического процесса.1835658 Таблиц1 Определение эффективности инактивации вируса ящура в клетках ВНК.21 и СП с помощью соленой кислоты Зкспозициялмин Темпе- ратура име. Концен. Оценка интел. 1 2 3 4 5 В 7 В Я 10 ание наличие остаточного вируса в препврвтаклч ост оленой ислоты Т НК+37 температуре; + - выделена остаточная вирулентностьл + - остаточная вирулвнтность выявлена в резульптате 1. ь Кт- комнатн алых пасса льту. кле- ак трация (нор.слзль процес.са акти.ееции,чС КТ +37 КТ +37 КТ сненостн НРИФкре10 1835658 Таблица 2 Эффективность различных способов инактиаации вируса ящура при изготовлении препаратов иммуносорбента для постановки НРИФСравнительная оценка специфичности и чувствительности выявления постинфекционных антител в РИФ с иммуносорбентами, приготовленными разными способамиТит ы антител Способ пол ения им носо бентаХарактеристика исследуемых сы- вороток ММ проб предлагаемый прототип неинактивированные слай ы Нормальные (отрицательные)П р и м е ч а н и е. В опытах 1 и 3 использовали инактивированные препараты инфицированных вирусом клеток ВНК. В опыте Ф 2 с этой целью использовали клетки СП и в опыте М 4- культура клеток БП.Таблица 31835658 12 Продолжение табл. 3 Тит ы антител Характеристика исследуемых сы- вороток Способ пол чения имм носо бента ЬМ проб предлагаемый прототип неинактивированные сдай ы 24 25 26 27 28 29 30 Сыворотки неизвестного происхождения из очага ящура 1:13,0+ 19,0 1:4,0+6,4 1:5,0+7,0 Таблица 4 Результаты определения сроков годности иммуносорбентов, приготовленных разными способамиНачиная с 4 месяца хранения иммуносорбента, интенюоресценции уменьшается на 1-2 креста,ость специфической иммуноф 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 1:401:401:401:801;801:401:40152 +17 6Не активн.1:40Не активн.1;801:10Не активн.То же 1:401:201:201:201:401:201;201:31+15,8Не активн.1:20Не активн.1:201:10Не активн.То жен 1:401:201:201:401;401:201:201,34+13,0Не активн,1:20Не активн.1:20Не активнТо жен13 1835658 14 Составитель Ж. ШажкоТехред М.Моргентал Корректор Е Папп Редактор Е. Полионова Заказ 1663 Тираж Подписное НПО "Поиск" Роспатента113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101Ф ормула изобретения СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АВИРУЛЕНТНОГО ИММУНОСОРБЕНТА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ПОСТИНФЕКЦИОННЫХ АНТИТЕЛ ПРИ . РЕТРОСПЕКТИВНОЙ ДИАГНОСТИКЕ ЯЩУРА, включающий получение инфицированного вирусом препарата клеток, его фиксацию на подложке и последующую инактивацию интрацеллюлярного вируса, оаиичзющийся тем, что, с целью упрощения и сокращения времени технологического процесса при сохранении исходной серологической активности и стабильности иммуносорбента, для инактивации интрацеллюлярного вируса фиксированный препарат клеток смачивают 0,01 - 0,001 10 н. раствором соляной кислоты в течение 3 - 5 мин.

Смотреть

Заявка

4804610/13, 19.03.1990

Всесоюзный научно-исследовательский ящурный институт

Шажко Ж. М, Мезвришвили Л. Б, Жучкова Л. Г, Рахманов А. И, Романова М. Ж

МПК / Метки

МПК: G01N 33/531, A61K 39/135, C12N 7/06

Метки: авирулентного, выявления, иммуносорбента, ретроспективной, диагностике, постинфекционных, антител, ящура

Опубликовано: 20.03.1996

Код ссылки

<a href="http://patents.su/7-1835658-sposob-polucheniya-avirulentnogo-immunosorbenta-dlya-vyyavleniya-postinfekcionnykh-antitel-pri-retrospektivnojj-diagnostike-yashhura.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентов СССР">Способ получения авирулентного иммуносорбента для выявления постинфекционных антител при ретроспективной диагностике ящура</a>

Похожие патенты