Рекомбинантная плазмидная днк plt21, кодирующая полипептид со свойствами лимфотоксина человека, и штамм бактерий escherichiacol продуцент полипептида со свойствами лимфотоксина человека

Скачать ZIP архив.

Текст

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСГ 1 УБЛИК 1709731 А 12 й 15(12, 15(77 ЗОБРЕ МУ СВИДЕТЕЛЬС ксина челов а со - прод авляет собоиа 25000 Да. Вксин главнымпированнымич 1 ио и и ччото природный ГОСУДАРСТВЕ ННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИГ 1 РИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ Иб) 30 07. 93. Бюл Мф 28(54) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯДНК р Т 21, КОДИРУЮЩАЯ ПОЛИПЕПТИДСО,СВОЙСТВАМИ ЛИМФОТОКСИНА ЧЕЛОВЕКА, И ШТАММ БАКТЕРИЙЕЗСНЕВСНА СО 1-ПРОДУЦЕНТ ПОЛИПЕПТИДА СО СВОЙСТВАМИ ЛИМФОТОКСИНА ЧЕЛОВЕКА157) Изобретение относится к биотехноло-гии, в частности к генетической инженерии,и позволяет получать микробиологическимсинтезом новь 1 й палипептид со свойствамилимфотоксина человека при упра 1 ценной Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и представляет собой сконструированную и ч 1 го рекомбинантную плазмидную ДНК, содержащую полусинтетический ген лимфотоксина человека; промоторы ранней области бактериофага Т 7 и синтетический участок инициации трансляции, обусловливающий биосинтез полипептида с биологи 11 ВдатмвтИИИвЕ И Я .."."."технологии его получения. Целью изобретения является повышение выхода палипептида со свойствами лимфотоксина человека.Создана новая рекомбинантиая плазмидар Т 21, кодирующая полипептид, представляющий собой укороченный на 21 аминокислотный остаток лимфотоксин человека иштамм Е.со 20050(р Т 21, обеспечивающий высокий уровень биосинтеза полипептида со Свойствами лимфотоксина человека.Рекомбинантная плазмида р Т 21 содержитполусинтетический ген полипептида саФсвойствами лимфотоксина человека. Она со- .стоит из НпбКрп - фрагмента плазмидырТИР 31, содержащего тандем промотооовтранскрипции А 2 и АЗ ранней области бактериофага Т 7. терминаар тр;,н;,крипции БфагаЛи геныр-лактамазы и хлорамфениколацетилтрансферазьг, и Крп(Нпс- фраг-.йента. содержащего синтетический участокинициации трансляции и мутантный генамлимфотоксина человека. Штамм ЕзсЬегсна Бса 36.20050(р Т 21 обеспечивает высокийуровень биосинтеза полипептида со свойст- двами лимфотоксина человека и упрощеннойтехнологией его выделения, 2 с.п,ф-лы, 2 ил,О ческой активностью лимфато ка, а также штамм Езс 1 ег 1 сЬ цент зтого полипептида.Лимфотоксин ЛТ) предс гликопротеин с мол. м, окоп организме человека лимфото образом прадуцируется акти Т-лимфоцитами, В опытахп было продемонстрировано. ч(гликозилированный) и рекомбинантный (негликоэилированный) лимфотоксин вызывает геморрагический некроз некоторых видов солидных опухолей, гтричем как и в случае фактора йекроэа опухоли особенно эффективно его цитотоксическая актив ность проявляется на опухолях с повышен, ной Ммигнатностью. Как и фактор некрозаопухоли лимфотоксин, являясь иммуномодулятором широкого спектра действий, проявляет свою,цитотоксическую активность .Високоизбирательно, воздействуя лишь на опухолевые клетки и не затрагивая здоровые; нетрансформированные клетки. Кроме того, следует отметить, что лимфотоксин обладает,выраженным противовирусным дейСтвием ПО ОтношвниЮ к ряду ДНК- и РЙК-содержащих вирусов, Все это делает иедицинское применение лимфотоксина человека чрезвычайно перспективным.Известен способ получения лимфотоксиначеловека, основанный на культивировании опухолевых линий клеток человека ЯРМИ 788 и АСБ. которые при индукции Форболовыми эФирами, бактериальнцми эндотоксинами и конканавалином А секретируют лимфотоксин во внеклеточную средуНедостатками этого метода являютсячрезвычайно низкий выход целевого продукта, трудности крупномасвтабного культиаирования клеточных линий и, как следствие,. высокая стоимость препаратов ЛТ,, ф. Значительно более перспектйвным является спосОб получения лимфотоксина микробиолОгическим синтезом; который обеспечивает возможность получения целе, вого продукта со значительно более высокам выходом из сравнитально. недорогого исходного сырья. Использование при этом химического подхода позволяет создать оптимальные для бактериальной экспрессии варианты структурного гена, а также регуляторных элементов, контролирующих его экспрессию.Известна рекомбинантная плазмидар 1.Тгр 1, кодирующая полипептид со свойствами лимфотоксина человека, в которой ген ЛТ экспрессируется под контролем промотора триптофанового оперона. Сведения об уровне биосинтеза, лимфотоксина штаммом Е,соИ. содержащий плазмиду р 1.Т 1 гр 1, отсутствуют,Известна рекомбинантная плазмидар 1.Т 131 асб.2, кодирующая полипептид со свойствами пимФотоксина человека, сконструированная на основе плазмидного вектора ОКК 223.3, Плазмида р 1.Т 1 ас 6-8,2 СОДЕРжИт УКОРОЧСИНЫй ГЕН, КОДИРУЮЩИЙ бвлок. у которого в отличие от природногобелка вместо первых десяти М-кбнцевыхаминокислотных остатков имеется последовательность Азр 1 еи. Такая конструкция в 5 штамме Е.соИ,1 М 105 при индукции изогропилтиоф- галактозидом (РТ 6) обеспечивает экспрессию измененного гена ЛТ,.причем биологически активный белок составляет 1 Я, суммарного белка бактерий.10 Недостатком плазмиды р 1.Т 1 ас 6,8-2 яв. ляется недостаточно высокий уровень биосинтеза ЛТ,.обеспечиваемый содержащимее штаммом-продуцентом, а также необходимость в этом случае и в случае плазмиды 15 р 1 Ттгр 1 Осуществления нетехнологическойстадии индукции биосинтеза при п"чениилимфотоксина, так как экспрессия генов ЛТв этих конструкциях индуцибельна.Кроме того, недостатком известных 20 плазмид является также то, что все они имеют малопригодную для генно-инженерныхопераций рестриктную карту, что значительно затрудняет дальнейшие операции по усовершенствованию плазмидных 25 конструкций с целыю достйжения макси- .мальной экспрессии полусинтетйческого гена ЛТ.ИзвеСтная рекомбинантная плазмидная ДНК.р 1.Т 9, кодирующая укороченный с.30 й.конца полипептид со свойствами лимфотоксина человека, в котором 9 М-концевыхаминокислот заменены остатком валина.Экспрессия гена укороченного полипептида в плазмиде р 1 Т 9 контролируется консти.35 тутивными промоторами:А 2 и АЗ раннейобласти бактериофага Т 7 и синтетическимучастком инициации трансляции, ШтаммЕ,СОИ 36 20050, содержащий плазмидур Т 9, обеспечивает высокий уровень пол ипептида со свойствами пимфотоксина человека свыше 4 х 10 ед/мл клеточной, йсуспензии),По принципу конструирования рекомбинантная плазмида р 1 Т 9, содержащая иэ мененныю ген лимфотоксина, являетсянаибодее близким техническим решением кизобретению.Целью изобретения является повышение выхода полипептида со свойствамилимфбтбксийа человека.Поставленная цель достигается с помощью новой рекомбинантной плазмиды р 1.Т 21, кодирующей конститутивный синтез полипептида со свойствами лимфотоксина человека, и штамма Е.соИ ЯС 20050/р 1 Т 23, Обеспечивающего уровень экспрессии ЛТ 2 х 10 ед,мл клеточной суспензии при7плотности клеток 10 клеток/мп.9Рекомбинантнзя ппптмидная ДНКо.Т 21, кодирующая пп пц:пп 1 д по свойствами лимфотоксина человека. харэктериэу- Культурэльные призняки. Клетки хороется следующими признаками: шо растут.на простых питательных средах.. кодирует. аминокислотную последовэ.: При росте на егере "Дифко" колонии кругтельность лимфотоксина человека,у которо-, лые, гладкие, прижаты,.мутные. блестящиего делетирован 21 й-концевой 5 серые, край ровный. При росте в жидкихэминокислотный остаток, имеет мол.м, 262 средах (на минимальной среде с глюкозойМДа (4,02 т.п.о.), . или .В-бульоне) образуют интенсивнуюсостоит из: ровную муть. Нпб 11 /Крп - фрагмента ДНК плэзми- . Физико-биологические признаки. Клетды рТМР 31, содержащего тандем промото ки растут при температуре от 4 да 40 ОС приров А 2 и АЗ ранней области бактериофагэ оптимуме рН от 6,8 до 7,0. В качестве источТ 1, теРминатор транскрипции фага лямбдэ, ника азота используют как минеральные Ьоген ф -лактамазы и ген хлорамфениколэце- ли е аммонийной Форме, так и органические.тилтрансферазы(3,4 т,п,о.),. соединения в видв пептона, триптона,Крп 1/Нпб - фрагмента, содержащем 15, дрожжевого экстракта, аминокислот и т,д. 8синтетический саитинициации трансляции качестве источника углерода используюти мутантный геном лимфотоксина человека аминокислоты, глицерин, углеводы.(0,63 т,п.о,), Устойчивость к антибиотикаМ. Клеткисодержит: проявляют устойчивость к эмпициллив качестве генетического маркера ген 20 ну (до 300 мкг/мл) и хлорамфениколуф-лактамазы и ген хлорамфениколэцетилт- (до 500 мкг/мл), обусловленную наличиемрансферазы, детерминирующие устойчи плазмиды, а также к тетрэциклину (до 30вость трансФормированных плазмидой мкг/мл) благодаря наличию транспозонэ;р Т 21 клеток Е,со к пенициллиновым анти-. Штамм Е,со 36 20050/р Т 21 обуслоебиотикам и хлорамфениколу, . 25 лиеает. конститутивный синтвз полипептидауникальные сайты узнавания рестрик- . (фиг. 2) со свойствами лимфотоксина челове. ционными зндонуклеазамирасположеннь 1- ка на уровне 2 х 10 ед/мл клеточной суспен7ми на следующих расстояниях вправо от зии, что составляет свыше 25 ф тотальногосэйта Крп 1: ОМ - 129 нуклеотидое, Зэ - клеточного белка бактерий и превышает поч618 нуклеотидовНи - 630 нуклеотидов, 30 казатели известных штаммов Е,со - продуИсо - 1181 нуклеотид, йде - 1955 нуклео- центов лимфотоксина,,тидае. П р и м е р 1, Химический синтез олигоРекомбинантная плазмида р Т 21 со- нуклеотидов. Синтез олигонуклеотидов выдержит полусинтетический мутантный ен полняют твердофазным фосфорамидитнымлимфотоксина человека. Источником для ее 35 методом на ДНК-синтезаторе Зузтеаполучения была рекембинантнэя плазмида (ВесЬпап) с наращиванием олигонукле.р Т 16, содержащая полусинтетический ген, отидной цепи в направлении от 3 -конкодирующий последовательность природ- ца к 5-концу с помощью защищенныхного негликозилированного лимфотоксинэ фосфамидитов - 5 -диметокситритилчеловека. 40 й-ацил- дезоксинуклеозид-О-(метоксиНа фиг,.1 изображена частичная струг д и и 3 о и р о и и л а м и н о ) - ф о с ф и т о в,тура плазмиды р Т 20(нумерация аминокис- активированных тетрэзолом. Синтез проволотпо последовательности лимфотоксина)и дят в масштабе 0,5-0,1 мкмоль, используя всхема локализованного олигонуклеотид.на-качестве носителя пористое стекло (размерправленного мутагенеза плазмиды рО 2 О, 45 пор 500 А, рязме р частиц 40-80 мкм), к кото.на фиг. 2 представлена структура полйпеп- рому через 3-сукцинэтную связь присоедитида. кодируемого рекомбинантной:плазмй-: няют первое нуклеозидиое звено (нагрузкадой р 1.Т 21, 20-30 мкмоль/г), Используют известныйДля получения бэктериальиого штэм синтетический цикл с тем лишь отличием,ма - продуцента полипептидэ с биолоече-, 50 что после реакции конденсации проводятской активностЬю лимфотоксинэ человека . промывку смолы смесью тетрагидрофуранвплазмидой р Т 21 трансформируют момпв-пиридий- вода(5;3:2). После окончания синтентные клетки Е.со Ы 20050, . теза защитные группы удаляют последоеаПолученный таким образом цтамм тельной обработкой тиофенолятомЕ,со 3620050/р Т 21 характеризуетсяеле+ 55 триэтиламмония и конц, аммиаком. Придующими признаками. зтом происходит Отделение алигонуклеаотиМорфологические признаки, Клетки да от носителя. 5-Диметоксвтритильнуюмелкие, утолщенной палочковиднай формы, группу удаляют кислотной обработкой играмотрицательные. неспоронасныволигануклеотид бчищают электрофорозом в20% ПААГ, содержащем 7 М мочевину. Вы- Аликвоту реакционной смеси используют ход 1-5 о.е, для трансформации компонентных клетокП р и м е р 2. Конструирование рекомби- Е.сой. Трансформанты высееают на чашкинантной плазмидной ДНК р.Т 21. сВ-агаром, содержащим ампициллинДля приготовления вектора ДНК плаз (100 мкг/мл) и хлорамфеникол. Скрининг ремиды рТИРЗЗЛ (10 мкг) обрабатывают е 70 . комбинантое проводят с помощью гибриди-мклбуфераВ(20 мМтрис-НС 1,рН 7,5,10 мМ зации колоний и з 1 ц с р-меченнымиэг.: МдС 2, 50 мМ ИаО, 5 мМ меркаптоэтанол) олигонуклеотидамии (И). Из клоное, гибрестриктазой ХЬо (20 ед.) в течение 1 ч при ридизирующихся с олигонуклеотидом (И) и ЗУС. Реакционную смесь охлаждают до 10 негибридизующихся с олигонуклеоитидом 10 ОС, прибавляют четыре дезонксинуклео- (, выделяют ДНКи анализируют с помощью.эйдтрифосфата до концентрации 50 мкМ эндонуклеаз НаеИ и Мзр и определением и 10 ед. ДНК полимеразы 1 Е,са (фрагмент . нуклеотидной последовательности регуляКленова), инкубируют 1 ч при 10 С, после торной области и начала структурного гена.чего реакцию останавливают прибавлением 15 Одну из полученных таким образом реком- ЕОТА до концентрации 25 мМ. Смесь депро- бинантныхДН К, р.Т 20, используют для теинизируют двухкратной фенольной экст- дальнейшего конструирования,ракцией, ДНК высаживают этанолом; ПримерЗ. Конструирование рекомбипромывают 70-ным этанолом, высушива- нантной плазмидной ДНК р Т 21,ют, растворяют в 50 мкл буфера В и обра К раствору 10 мкг ДНК плаэмиды р.Т 20 батывают 15 ед, эндонуклеазы НпбИ 2 ч в 100. мкл буфера Й прибавляют рестриктапри 37 С. Векторный Фрагмент величиной. зы Крп и НпбИ (по 25 ед, каждой) и инку,4 т.п;о, выделяют электрофорвзом в 1 ОВ бируют 1 ч при 37 С, после чего Фрагмент .МР-вгарозном геле, Затем обрабатывают (=700 и;о.) выделяют электрофорезом в 90 мкгДНК плазмиды р Т 16 в 500 мкл буфе 10-ном геле легкоплавкой агарозы, Анало-, ра й рестрикционной эндонуклеаэой Есой гичным образом гидролизуют 2 мкг репли- (100 ед,) в течение 1, 5 ч при 37 фС, После . кативной формы ДНК (РФ ДНК) фага этого прибавляют 100 мкл буфера. содержа- М 13 гпр 10 гидролизом той же смесью эндощего 66 мМ трис-НС 1; рН 8,0, 77 мМ йаС 1, нуклеаз и векторный фрагмент также очи мМ МдС 2 и 10 мМдитиотреит,и 50 еа.эк щают электрофорезом в.1%-ном геле зонуклеаэы 1 И Е.соИ (3 два), Отбирают легкоплавкой агароэы. Затем 0.5 мкг вектораликвоты по 300 мкл через 5, У и 9 мин и ного фрагмента лигируют с 0,1 мкг реакцию останавливают прибавлением 35 мкл Крп 1/НпбИ-фрагмента. полученного иэ , 100 мМ раствора спермина, Смесь выдер- плазмиды р Т 20, в 20 мкл буферча течежиеают 15 мин при ООС, центрифугируют 35 ние 10 ч при 13 С. Одной десятой частью 10 мин при 12000 об/мин, Осадок промы- лигаэной смеси трансФормируют компетенвают 80-нымзтанолом,содержащимОЗМ тные клетки Е.соИ ИКпмЯ. После ацетзт натрия и 10 мМ ацетат магния, сно- трансформации клетки смешивают и ри ва центрифугируют, после чего осадок. 42 С с 3 мл 0,8% .В-агара, содержащего растворяют в 300 мкл буфера, содержащд 40 мкг/мл 5-бром-хлор-р -О-галактопираго 50 мМ ацетат натрия, рН 5,0, 30 мМ ЙаС . ноэид. (Х-ба), 1 мМ. изопропилтио-Р -О-гаимМ Еп 304, прибавляют 40 ед; нуклеазы лакто-пиранозид и 200 мкл культуры клеток из золотистой Фасоли и смесь инкубируют Е,со В/К-б ец 18 в логарифмической фазе 30 мин при 30 С. Реакцию останавливают роста. Смесь выливают на чашки с 1,6 осаждением ДНК спермином, как описано 45 .В-агаром.и.после застывания инкубируют выше. Осадок. промывают.этанолом, высу ч при 37 ОС, Из фаговых клонов, образуюшивают. растворяют в 300 мкл буфера й и щих бесцветные бляшки. выделяют деухцеобрабатывают 80 ед. рестриктаэы НпбИ в почную РФ ДНК и ее анализируют с течение 4 ч при 37 С, после чего фрагменты . помощью совместного гидролиза рестрик- ДНК нужного размера (около 600-650 п.о.), 50 тазами Крп и НпбИ 1, Для дальнейшей расодержащиебольшуючасть геналимфоток- ., боты.используют рекомбинантный фаг сина, выделяют при помощи электрофореза М 13.Т 20; содержащий нужной величины в 1%-ном геле легкоплавкой агарозы, . Фрагмент Крп /НпбИ. Для выделения од 0,2 мкг полученного таким образом ноцепочечной(+)-ДНКк 10 мл 2 х В-бульонаФрагмента ДНК лигируют в 25 мкл буфера . 55 прибавляют 0,1 мл ночной культуры клеток (20 мМ трис-НО; рН У,5, 10 мМ МдС 2, Е.соИ ЮКцотов; в смесь вносят кусочек 0,2 мМ гАТР, 10 мМ дитиотреит) С 1 мкг верхнегоагара.содержащего.индиеидуальвекторной ДНК. полученной, как описано ную фаговую бляшку, и инкубируют при выше, иэ плазмиды рТИРЗЗ, с помощью аэрации 6 ч при 37 С. Затеи легки центри-50 ед. Т 4 ДНК-лигазы в течение 6 ч при 15 С.(ПЭГ) и 2,5 М ИаС 1, выдерживают 15мин при 20 С и центрифугируют 5 мин при 512000 об/мин, Осадок растворяют в 100 мклбуфера, содержащего 20 мМ трис-НС 1, рН8.0, 1 мМ ЕОТА, раствор трижды экстрагируют фенолом и ДНК высаживают. зтанолом. 10Для проведения мутагенеза 0,5 мкг(+)-.нити ДНК фага М 131.Т 20 смешивайт с250 пмоль фосфорилировзнного.олигонуклеотида (11) в 50 мкл буфера . без дитиот-реита и гАТР, смесь нагревают а течение .1515 мин при 80 С. после чего медленно втечение 3 ч охлаждают до 15 С, затем прибзвляют с 1 АТР, ббТР и ТТР до концентрации100 мкм каждого и 15 ед. ДНК.полимеразыЕ.со (Фрагмент Кленова), Смесь инкубйру- .20. ют 4 ч при 15 С, затем прибавляют гАТР доконцентрации 0,1 мМ, дитиотреит до кон: центрации 10 мМ и 100 ед. Т 4 ДНК-лигазц ипродолжают инкубацию при той же температуре еще в течение 10 ч, Пятую часть реакционной смеси используют для.трансформации компетентных клеток Е.со. ИКпщ 13, описано выше, Скринингрекомбинантных фагов проводят гибридизацией.с 5-( Р)-меченным мутагснизирующимоли 30гонуклеотидом (В) в условиях жесткой отмывки (55 С, 2 х 35 С). Клетки Е.со ЮК"вцзт, содержащие гибридиэующиеся с Зон.дом фаги, выращивают, из них выделяютрепликативную форму фаговой ДИК и под 35вергают анализу с помощью совместного гидролиза рестриктазами Крп 1+Рзт и ХЬо+.Рзд,Рекомбинантные фаги, содеркащие ДНК,нечувствительные к рестриктазе ХЬо и, образующие при гидролизе, смесью рестриктаз Крп и ХЬо 1 фрагмент. величиной 342 п,о.,М 13.;Г 21, отбирают для дальнейшей работы, Затем выделяют Крп/Нпс 1- Фрагмент ДНК этих Фагов, реклонируют его Йплазмиду рТМР 31 Л по тем же рестриктным свойствам, как описано выше. В ре.зультате получили новую рекомбинантную.плазмидную ДНК р 1 Т 21, структуру которой подтверждали рестриктным знализомс помощью эндонуклеаз НаеВ и Мар 1, а 50также определением нуклеотидной после, довательности ппзэмиды между сайтзмиКрп 1 и Н 1 п 0111.Плазмидз р Т 21 детерминирует био.синтез попипептидз, представляющего со" 55бой укороченный с И-конца ие 21.аминокислоту лимфотоксин человека,П р и м е р 4, Получение. штамма.прбду" цента полипептидз со свойствами лимфотоксина человека. Г 1 лаэмидой р 1 Т 9 трансформируют ком. петентные клетки Е.со 1 ЬО 20050 по извесь. ному методу и получает штамм-продуцент полипептидз со свойствами лимфотонсина человека. .Г 1 р и м е р 5. Определение продуктивности штамма Е.со - продуцента пол. ипептидз со свойствами лимфотпксина человека,ЛКлетки Е,со ЯС 20050/р.Т 21 выращивают при 37 С 1 в 20 мл .В-бульона в течение 20 ч на качалке при скорости вращейия 190 об/мин,отбирают пробу 2 мл, клеткицентрифугируют 10 мин при. 6000 об/мин,затем суспендируют в 1 мл буфера. содержащего 25 мМ трис-НО, рН 8,0, 0,5 мМ фе.нилметилсульфонилфторид и 5 мг/мллиэоцим, и инкубируют 30 мин при 25 С.оДля вскрытия клеток смесь замораживают в .течение 10 мийприС, а затем оттаиваютво льду; эту операцию повторяют трижды.после чего определяют содержание лимфотоксина в растворе измерением его биологической активности.Биологическую активность ЛТ определяют на культуре трансформированных мыШиных фибробластоа линии 1-.929, С этойцелью монослойную культуру клеток выращивают а СОз.термостате в 96-луночныхпластинах для культур клеток в средеОМЕМ,:содержащей 10%-ную сыворотку теленка, Для определения биологической активности культуральную среду заменяют насвежую среду ОМЕМ, содержащую 1-нуюсыворотку теленка, вктиномицин 0(1 мкг/мл).и клеточный лизат в двухкрзтных серийных разбаалениях (примерно соответствующих концентрации лимфотоксинаот 1 мкг/мл до 10 5 мкг/мл). Пластины сноваинкубируют в течение 16-20 ч в СОг-термостате, затем клетки прокрашивают трипановым синим и подсчитывают количествоок рз ше нн ых (жиз неспособн ы х) и неокрашенных (живых) клеток. За 1 единицуактивности принимают количество лимфотоксина, вызывающее гибель 50 О, трансформированных клеток,Таким образом, предлагаемая группаизобретений позволяет получать новый поНипептид со свойствами лимфотоксина человека, причем уровень биосинтеэа такогополипептидз составляет 2 х 10 ед./мл куль 7туры клеток, что составляет свыше 25 ф сумма рна го клеточн ого бел ка Е. с о 1 и риупрощенной технологии его получения засчет исключения стадии индукции бносинтеза белка,Формула и э обре те н и я1. Рекомбйнантнвя плаэмидная ДНКр Т 21, кодирующая полипептид со свойст1709731 11 1;ИеФ 7 а 1 Агд Бег Зег. Зег Иа аеОЙАСйАОЗЙЙЙАИЙЙЙЙИИСХИЮО (ЮИ АОА ТСС ЙИ АСС СТ ОСО.2061 й Иа А 1 а Ащ ОЫ Н 18 Уго Ъуе МеФ 838 Ьеи АХа Е 18 Зег %Ъг Ьец616 ХОР ССО 067 ОАС ОАО Сбб ААО АУС СА 2 СИ ССС САО АСС ААС СТОСССАаАСКСССОжСАОСАССС6 СОААО,СоЖТЬССТййййОАТТЖМЯМТййСЮйИО СТТСОСЯСВИЫАССТС. ,йЮАИЙЙАС-СААССОСТСТССЗ(1 ХХ) вами лимфотоксинэ человека. мол. м, 2,62 МДа и размером 4,02 т.п.осодержащаяНпб-Крп - Фрагмент ДНК плазмиды рТМГ 31 с тандемом промоторов А 2 и. АЗ ранней области бактериофага Т 7, терминатором транскрипции фага лямбда, генома-лактамазы и геном хлорамфениколацетилтрансферазы размером 3,4 т.п.о.,Крп 1-Нпб - Фрагмент с синтетическим сайтом инициации трансляции и мутантным геном лимфотоксина человека. кодирующим аминокислотную последова. тельность лимфотоксина человека, у которого дел етирована 21 М-концевая аминокислота, размером 0,63 т,п.о.,генетические маркеры:ген ф -лактамаэы - ген устойчивости кпенициллиновым антибиотикам,ген Св - ген устойчивости к хлорамфе николу:уникальные сайты узнавания рекстрикционных зндонуклеазами, расположенные на следующих расстояниях вправо от сайта КрпИЗО 129 нуклеотидов, За - 618 нук.10 леотидов. Нпб - 630 нуклеотидов. МСО -1181 нуклеотид, йбе - 1955 нуклеотидов. Й, Штамм бактерий Езстегста со ВКПМ 8-5279 - продуцент полипептида со15 своэствами лимфотоквина человека,Ф ктор Л в нчакбвв ва, Ж.35, Р нат "П тел ьски ЭОДСТЭ нно Заказ 8/Составитель Е,КузнецТехред М,Моргвнтал иражго комитета до изоб а Коррвкто Подписноеениам и открмтиям ори ГКНТ СССР нт", г. Ужгород, ул.Гагарина, 10

Смотреть

Заявка

4834066, 21.03.1990

ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ ИМ. М. М. ШЕМЯКИНА, ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ПРИКЛАДНОЙ ЭНЗИМОЛОГИИ

КОРОБКО В. Г, ДОБРЫНИН В. Н, ФИЛИППОВ С. А, ЧУМАКОВ А. М, ШИНГАРОВА Л. Н, ДАВЫДОВ И. В, БУМЯЛИС В. А, ЯНУЛАЙТИС Е. А

МПК / Метки

МПК: C12N 15/12, C12N 15/77

Метки: кодирующая, свойствами, полипептид, рекомбинантная, плазмидная, днк, лимфотоксина, plt21, escherichiacol, человека, продуцент, бактерий, полипептида, штамм

Опубликовано: 30.07.1993

Код ссылки

<a href="http://patents.su/7-1709731-rekombinantnaya-plazmidnaya-dnk-plt21-kodiruyushhaya-polipeptid-so-svojjstvami-limfotoksina-cheloveka-i-shtamm-bakterijj-escherichiacol-producent-polipeptida-so-svojjstvami-limfoto.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентов СССР">Рекомбинантная плазмидная днк plt21, кодирующая полипептид со свойствами лимфотоксина человека, и штамм бактерий escherichiacol продуцент полипептида со свойствами лимфотоксина человека</a>

Похожие патенты