Рекомбинантная плазмидная днк, кодирующая кор-антигенвируса гепатита в, лишенный днк 39с концевых аминокислот с экспонированным на его поверхности эпитопом pre s 1-55, способ ее конструирования и штамм бактерий

Скачать ZIP архив.

Текст

лучение кор-анс экспонировандным эпитопом, к нуклеиновым ь изобретения - и ируса гепатита В оверхности чужер дающим сродство нантныи генруюций син ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯПРИ ГКНТ СССР ПИСАНИЕ ИЗОБ ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(71) Институт органического синтеза АНЛатвССР(54) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯДНК.КОДИРУЮЩАЯ КОР-АНТИГЕН ВИРУСАГЕПАТИТА В, ЛИШЕННЫЙ ДНК 39 С КОНЦЕВЫХ АМИНОКИСЛОТ С ЭКСПОНИРОВАННЫМ НА ЕГО ПОВЕРХНОСТИЭПИТОПОМ рге 32(1-55), СПОСОБ БЕ КОНСТРУИРОВАНИЯ И ШТАММ БАКТЕРИЙЕЗСНЕЮСНА СО- ПРОДУЦЕНТ КОР-.АНТИГЕНА, ВИРУСА ГЕПАТИТА В, ЛИШЕННОГО 39 С КОНЦЕВЫХ АМИНОКИСЛОТС ЭКСПОНИРОВАННЫМ НА ЕГО ПОВЕРХНОСТИ. ЭПИТОПОМ рге 52 (1-55)(57) Изобретение относится к микробиологической и медицинской промышленности,генной и белковой инженерии, биотехнолоретение относится к микробиолои медицинской промышленйости, белковой инженерии, биотехноло 1713930 А 1 гии. Целью изобретения является получение кор-антигена вируса гепатита В с экспонированным на его. поверхности чужеродным эпитопом, НЕ обладающим сродством к нуклеиновым кислотам, в данном случае получение в Е;соП химерных белковых структур с экспонированным на поверхности кор-антигена, лишенного 39 С-концевых аминокислот, участком рге 32 Н В Ч с 1 и о 55 аминокислоту. Плазмида р ОС 52-142 имеет размер 7071 п.о., обеспечивает экспрессию: гена НВсА 9- Л рге Я 2 (1 - .55), кодирующего синтез рекомбинантных капсидных структур, обладающих антигенностью и иммуногенностью НВсА 9 и участка ргеЯ 2 вируса гепатита В; плазмида не коньюгативна. Уникальные сайты рестрикции: ВааН 1, ЗрЫ, За, Кгп 1, арпа, Ат 111, Рз 11, Яса 1 ХЬа. Способ конструирования плазмиды рОСЯ 2 - 142 заключается во встраивании Мвт 11 - Ма 1 фрагмента плазмиды рНВ 320 в плазмиду рНВс 1315 по сайтам ЕсоВЧ и Са после 144-аминокислоты гена 1-ВсА 9. Штамм Е. со 11 ВКПМ В-продуцент рекомбинант-: .ных капсидных структур НВсА 9 Л -рге Й 2 (1 - 55), обеспечивающий выход целевого продукта в количестве 13,2;4 суммарного клеточного белка, 3 табл,кислотам и, в конкретном случ в Е,соИ химерных белковых с понированным на поверхнос на, лишенного 39 С-концевых участком рге 32 НВЧс 1-й по 5 лоту.Сконструирован рекомб НВс А 9 Ь - рге 32(1-55), кодтеэ соответствующего белка, плаэмидырСС 52-142 для его экспрессии, а такжештамм-продуцент Е,соИ К 802 .(рОСЯ 2-142)рекомбинантной кэпсидной структуры,обеспечивающий выход конечного продукта 5в количестве не менее 13.2 суммарногобелка Е.со 1.Рекомбинантная плазмида рОС 52-142.состоит из следующих элементов: ДНКплаэмиды рНВс 1315, которая представляет 10собой вариант плаэмиды рНВсЗ, содержащей ген НВсА 9 с оптимизированным участков инициации трансляции, но с мутантнымгеном НВсА 9, содержащим полилинкернуювставку по 144-й аминокислоте и преднаэначенным для внедрения чужеродных последовэтельностей по этому участку,протяженность 6900 п.о., фрагмент геномаНВЧ иэ плэзмиды рНВ 320 (7), соответствующий последовательности между сайтами 20рестрикции УзтИ 1794 и М 1 эИ 11626 и кодирующий участок рге 52 (155) протяженностью168 п,о. Размер плазмиды 7050 п.омол,м,4,5 МД.В состав ДНК рекомбинантной плаэмиды р 632-142 входят гены: ген НВс А 9 Л -рге 52 (1 - 55), обеспечивающий синтез конечного продукта; ген На, обеспечивающий устойчивость к ампициллину,Ген НВсА 9 Ь - рге 52 (1-55) находится ЗОпод контролем тандема промоторов Ргр,Плазмида рОСЯ 2-142 амплифицируетсяпри добавлении в среду хлорамфеникола,неконьюгативна.Сущность способа конструирования 35плээмиды рОСЯ 2-142 состоит в том, чтофрагмент гена рге 52, именуемый НВЧрге 52(1 - 55) протяженностью 168 п.о. внедряютпо сайтэм рестрикции ЕсоВУ и Са 1 в векторную плазмиду рНВ 1315 с образованием рекомбинантного гена НВсА 9 Ь- рге 2(1-55).Штамм-продуцент НВсА 9 Ь - рге 52(1 - 55) получают трансформацией клетокЕ,соИ К 802 рекомбинантной плазмидойДН К рОСЯ. 45Морфологические признаки; клетки палочковидной формы, грамотрицательныеКультуральные признаки: клетки растутна обычно используемых питательных средах, образуют колонии средней величины. 50Физико-биохимические признаки: оптимальная температура культивирования37 С, оптимум рН 7,0-7,4. В качестве источника углерода используют углеводы, в качестве источника азота - минеральные соли, а. 55также органические соединения в аиде пептона, триптора. аминокислот.Устойчивость к антибиотикам: устойчив к ампициллину, то обусловлено наличиемплаэмиды, Присутствие в штамме плазмидной ДНК подтверждается путем проверки устойчивости к ампициллину, а также путем выделения и анализа плазмидных ДНК экспрессс-.методом.Штамм депонирован в коллекции Центрального музея промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ В,П р и м е р 1. Конструирование рекомбинатной плаэмидной ДНК рСС 2-142,10 мкг плазмиды рНВ 1315, выделенной стандартным методом, расщепляют(частично) 3 ед. рестриктазы ЕсоВЧ в 25 мкл раствора, содержащего 10 вМ трис-НО, рН 7,5.; 50 вМКаО. 10 вММ 9 С 2 и 1 вМ дитиотрейтол (ДТТ) в течение 30 мин при 37 С, Рестриктаэу анактивируют 15-минутным прогреванием при 65 С. К 20 мкл реакционной смеси добавляют 6 мкл раствора Б, содержащего 70 вУ трис-НС 1, рН 8,0; 70 вМ У 9 С 12 и 10 вУ ДТТ, воду до конечного обьема 60 мкл и 15 ед. рестриктаэы Оа. Инкубацию при 47 С проводят в течение 2 ч. После очистки на эгароэном геле (на бумаге ДЕ) известным методом фрагмент ДНК с мол,м, 4,42 УД (размером 6900 п.о.) растворяют в 20 мкл Н 20 (ДНК.1),50 мкг плазмиды рНВ 320, полученной очисткой на оксиапатитерасщепляют 25 ед, рестриктаэы Нра 1 и 25 ед, рестриктазы Есо 81 И (Мз 1 И) в 250 мкл раствора В, содержащего 10 вМ трис-НО, рГ 8,5; 10 вМ У 9 С 12 и 1 вМ ДТТ в течение 3 ч при 37 С, После очистки на эгарозном геле на бумаге ДЕ) известным методом фрагмент Нра 1816-МмИ 1794 с мол,м. 0,62 Уд (размером 978 п,о,) растворяют в 20 мкл Н 20 (ДНК 2).2 мкг ДНК 2 расщепляют 4 ед. рестриктээы Н 1 п 1 И (йа И 1) в 20 мкл раствора Г, содержащего 10 вМ трис-НС 1, рН 8,5; 10 вМ У 9 О 2 и 50 вМ ИаС 1 в течение 2 ч при 37 С. Фрагмент МзтИ 1794-МаИ 11626 размером 168 и о. после очистки на 2-ном агарозном геле (нэ бумаге ДЕ) растворяют в 10 мкл Н 20 (ДН К 3).Выравнивание липких концов вектора и клонируемого фрагмента проводят совместно, для чего 0,1 мкг ДНК 1 и 0,05 мкг ДНК 3 инкубируют с 4 ед. Т 4 ДНК-полимеразы в 10 мкл раствора Д, содержащего 20 вМ трис- НО, рН 7,5; 10 вММ 9 О 2, 1 вМ ДТТ и 33 вМ дАТР, бСТР, с 1 ТТР, 06 ТР в течение 30 мин при 37 С. Т 4 ДНК-полимеразу инактивируют 15-минутным прогреванием при 65 С,После выравнивания липких концов за-. шивку вектора и клонирующего фрагмента проводят в 12 мкл раствора Д с добавлением 10 ед, Т 4 ДНК - лигазы и АТР до конечной концентрации 500 вМ в течение 12 ч при4 С. К реакционной смеси добавляют 100 мкл клеток Е.соИ ЙВ 1, обработанных 100 тМ СаС 2 (конечная концентрация 5 10 клеток/мл) для трансформации клеток по известному методу. 5Отбор клонов осуществляют путем рестрикционного анализа плазмидной ДНК, выделенной экспресс-методом. Плазмида с ожидаемой рестрикционной картой получает наименование рССЯ 2-142. , 10Штамм-продуцент Е,.соИ К 802 (рОСЯ 2142). Выделение и очистка рекомбинантного белка НйсАд Ь- рге 32(1 - 55),Штамм-продуцент получают трансформацией клеток Е,со К 802,рекомбинантной 15 плазмидой рбС 52.142. Клетки выращивают в солевой среде М 9 с добавкой, г/л: казаминовые кислоты 10; глюкоза 2, ампициллин 0,02. до оптической плотности ОП 65 о 4 - 5, Клетки собирают центрифугированием и ли зируют в трехкратном объеме буфера, содержащего 0,05 М трис-НО, рН 8,0, 0,15 М КаС, 0,1 тритон Х 100, 0,005 М ЭДТА, 3 мгlмл лизоцима. После инкубации в.течение 30 мин при 40 С клетки подвергают трех кратному замораживанию - оттаиванию, добавляют дезоксирибонуклеазу и МдС 2 до конечной концентрации 20 мг/мл и 10 гпМсоответственно и инкубируют 30 мин при . 4 С, Лизат осветляют центрифугированием 30(10 000 д, 4 С, центрифуга). НВс Ад Ь - рге 52 (1-55) очищают следующим образом, Ли. зат подвергают фракционированию сульфатом аммония. НВс Ад Ь - рге 52 (1-55) собирают в осадке, полученном при 30% 35 насыщения. сульфатом аммония. Осадок растворяют в 0,04 М фосфате натрия, рН 8,0;0,15 М йаС, 0,1 тритоне Х 100 до конечйой концентрации белка 25-50 мг/мли 6-7 мл этого раствора наносят на колонку с Сефа-. 40 розой С 4 В (2,1 х 75 см), уравновешенную .тем же буфером, но без тритона Х 100, Фрак- ции. проявляющие НВсАд-активность, собирают и используют либо непосредственно, либо после концентриро вания переосаждением 50%-ным сульфатом аммония.Определение .НВсАд-активности методом РИД.Титр Н ВсАд определяют с помощью ра диальной иМмуно-диффузии по Ухтерлони. Для этого готовят двукратные серийные разведения клеточного лизата и титрируют против анти-НВс антител человека. В. качестве стандарта используют очйщенный 55 НВсАд, полученный из рекомбинантных бактерий (1 мг/мл), Результаты титрования НВсАд-активности методом РИД приведены в табл. 1. (синтез НВс Ад Ь-рге 32(1-55) в бактериях Е.соИ К 802, несущих рекомбинантную плазмидную ДНК рбС 52-142),Определение рге 32-активности методом иммуноблотинга. Мол.м. белка НВсАдЛ- рге 52 (1-55),Для иммуноблотинга клетки (6 мг) суспендируют в 100 мкл буфера для нанесенияобразцов на полиакриламидный гель, содержащего 2 0 -ныйдодецилсул ьфат натрия(ДСН) и 2 -ный.3-меркаптоэтанол и лизируют 2 мин прогреванием на кипящей водя;ной бане, Полученные лизаты (2 - 4 мг/млбелка) наносят на полиакриламидный градиентный гель (12-18) размером 150 хх 150 х 0,75 мм. Электрофорез проводят втечение 15 ч при силе тока: 7 мА, Послеэлектрофореза белки переносят на нитроцеллюлозу, Фильтры инкубируют с моноклональными:анти-рге Зр антителами мышиМАЕ в разведении 1;500 на буфере ТВЗ,содержащем 50 вМ трис-.НС. рН 7,8; 150.гп М Ка С 0,1 тритон Х 100. 1 БСА, в течение 15 ч при 20 С. После трехкратной отмывки буфером ТВЯ фильтры инкубируют 2ч при 20 ЯС с конъюгатом пероксидазы сантителами против иммуноглобулинов мыши в разведении 1:200; Фильтры отмывают буфером ТВЯ (3 - 5 раз) и проявляютдиаминобензидином. Лизаты клеток. штамма-продуцента обнаруживают при этом появление специфических зон окраски,соответствующих белку с мол.м. 22,3 МД(или длиной 212 аминокислот). что соответствует схеме конструирования. Контрольные лизаты клеток Е.соИ К 802 (рНВс 3) такихзон не обнаруживают.Электронномикроскопическая характеристика рекомбинантных капсидных структур Н Вс Ад Ь - рге 32 (1-55),Препараты очищенного белка НВсАдЬ- рге Я (1 - 55) готовят методом негативного контрастирования с применением 1-ного уран ила цетата и исследуют наэлектронном микроскопе ЕМ 100 С при ускоряющем напряжении 80 кВ и инструментальном увеличении 100 000 раз, Белок(1-55) образует капсиды диаметром 25 нм.Определенйе рге 52-активности в составе капсидных структур НВс Ад Ь - рге 32(1-55) методом энзимоиммунологическогоанализа на твердой фазе.В качестве твердой фазы используютполистироловые 96-вуночные планшеты дляиммунологических реакций. Очищенный белок НВс Ад Ь - рге 52 (1-55) разводят доконцентрации 10 мкг/мл в 50 вМ йаНСОзйа 2 СОз; рН 9,5 и вносят в лунки планшетовпо 100 мкл в каждую. Инкубируют 16 ч при37 С, после чего раствор удаляют из лунок,5 10 20 Ь -рге Я 2 (1-55) 25 рОСЯ 2-142, кодирующая кор-антиген вируса гепатита В, лишенный ДНК 39 С-концевых верхностиэпитопом рге.Я 2 (1-55) размером 7071 п.о. и мол.мас. 4,53 МД, содержащая 30 плазмидную ДНК рНВс 1315 размером 6900п,о ММИ 1794 - чаИ 1626, фрагмент плазмидной ДНК рНВ 320, кодирующий последовательность участка рге Яг вируса гепатита В, размером 17 п,о.,; уникальные;35 сайты рестрикции и их координаты;ВавН(О), зрЫ (1.91), ЯаИ(276), Ига(599), Япа(1871) Ай(2098), РзО(3236), Яса(3471), Ха(5176); гены, регуляторные участки, генетические маркеры: ген НВсАд Ь - рге Я 2 40 (1-55), обеспечивающий синтез рекомбинантных кэпсидных структур;.НВсА 9 . Ь рге Яг (1-55), координаты 5087-5740; тандем промоторов Ро р; ген Яа, обеспечивающий устойчивость к ам пициллину 45 (координаты 2918-3778). 50 55 планшеты высушивают. В лунки вносят моноклональные анти-рге Я 2 антитела мышиМАЕ в разведении 1:5000 на буфере ТВ.После инкубации в течение 2 ч при 37 Спланшеты отмывают 5-6 раз дистиллированной водой и вносят по 100 мкл. конъюгатапероксидазы хрена с белком Я.аогецз в разведении 1:5000 на буфере ТВЯ. После инкубации в течение 1 ч планшеты отмывают ипроводят цветную реакцию. В лунки вносятпо 100 мкл 0,25 6-ного раствора ортофенилендиамина 2 НС в 0,1 М цитрате натрия,рН 5,0, 0,02 Н 202, инкубируют 30 мин при20 ОС, реакцию останавливают добавлением100 мкл 0,1 й НС; Появление коричневой 1окраски свидетельствует о наличии рге Я 2 активности. Для количественной оценки активности измеряют оптическую плотностьпри 492 нм и определяк 3 т величину Р/й(табл, 2).Отсутствие реакции в отрицательномконтроле (НВсАд) свидетельствует о специфичности связывания анти-рге Я 2 антителрекомбинантными капсидными структурами НВс Ад Ь- рге Я 2 (1 - 55), Иммунологическая активность рекомбинантных антителприведена в табл. 2.Иммуноэлектронная микроскопия капсидных структур с использованием коллоидного золота,Капсиды НВсАд Ь - рге Я 2 (1-55) сорбируют на никелевой сеточке, покрытой формваровой пленкой, в течение 15 мин, Сеточкупромывают 0,5 мл раствора РВЯ, содержащего 0,05-ный Твин 20 (РВЯ - Твин 20) иинкубируют 15 мин в 0,03 мл 0,1 фб-ного раствора БСА в воде, промывают 0,5 мл РВЯ -Твин 20; инкубируют 15 мин в 0,03 мл раствора моноклональных анти-рге Я 2 антителмыши МАЕ в разведении 1;10, промывают0,5 мл РВЯ - Твин 20, инкубируют 20 мин в0,03 мл антител (кролика) против иммуноглобулинов мыши (в разведении 1;5); промывают 0,5 мл РВЯ - Твин 20. Сеточкупомещают на.1 ч в 0,03 мл раствора рА-АО,содержащего белок А, который коньюгирован с частицами коллоидного эблота диа.метром 8 - 10 нм, промывают.0,5 мл РВЯ -Твин 20 и затем 1 мл Н 20. Капсиды окрашивают методом негативного контрастирования 0,15 мл 2ного уранилацетата. Всеоперации выполняются при 20 ОС, В случаеповерхностной локализации соответствующих эпитопов кэпсиды на электронной микрофотографии окружены венчиком частицколлоидного золота.В качестве отрицательного контроля использованы капсиды НВсАд, не несущие эпитом рге Я 2 (1-55), Эти.капсиды не образуют комплексов с коллоидным золотом,Иммуногенная активность рекомбинантных капсид НВсАд.Ь- рге Я 2 (1-55),Для определения иммуногенности рекомбинантными капсидами НВсАд Ь.- рге Я 2 (1-55) иммунизируют кроликов. Для этого смешивают 2 мг антигена, растворенного в 1 мл физиологического раствора РВЯ, с.1,25 мл полного адъюванта Фрейнда и получают гомогенную эмульсию, Антиген вводят подкожно. Инъекции антигена повторяют на 14- й и 21-й день и с 28-го дня начинают брать кровь. Специфичность антител определяют методом ИФА с использованием двух анти- генов: НВсАд(для определения антиНВс антител (1 г-рге Я), белок-оболочки РНК-фага 1 г,несущий весь участок рге Я - для определения анти-рге Я 2, антител. Титры антител на 28-й день иммунизации приведены в табл. 3 (иммуногенность химерных капсид НВсАд Ф о р мул а и зоб рете н ия1, Рекомбинантная плазмидная .ДНК аминокислот с экспонирбванным на его по 2. Способ конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК рССЯ 2-142, заключающийся в том, что йа 1626 - . МмИ 1794, фрагмент длиной 168 п.о., кодирующий участок рге Я 2 (1-55), выделяют из плаэмиды рН В 320 п.о., заполняют и удаляют липкие концы с помощью ДНК полимераэы, встраивают в вектор для экспрессии рНВс 1315 по сайтам ЕсойЧ и Оа в положении 144 аминокислоты гена НВсА 9 так, что эа 144 аминокислотой образуется вставка рге Я 2 (1-55), что вызывает терминацию трансляции, исключающую 39 С-концевых1713930 10 Таблица 1 Таблица 2 Таб Составитель С.БандринРедактор Н,Яцола Техред М.Моргентал Корректор М,Дем аз бб 1 ТиражПодписное,ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ С113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 ул. Гагарина, 101 изводственно-издательский комбинат "Патент", г. Уж аминокислот гена НВсАд, трансформируют рекомбинантными ДНК штаммы бактерий ЕзсйегсЫа со, отбирают с помощью контактирования и выделяют из этих клонов целевую плазмиду,3, Штамм бактерий ЕзсЬегсЫа соВКПМ 8-4977 продуцент кор-антигена, вируса гепатита В, лишенного 39 С.аминокислот с экспонированным на его поверхности 5 эпитопом рге 32 (1-55),

Смотреть

Заявка

4728573, 10.08.1989

ИНСТИТУТ ОРГАНИЧЕСКОГО СИНТЕЗА АН ЛАТВССР

БОРИСОВА ГАЛИНА ПАВЛОВНА, БЕРЗИНЬ ИВАР ГУНАРОВИЧ, ГРЕН ЭЛМАР ЯНОВИЧ, ЛОСЕВА ВЕРА ЯНОВНА, ПЕТРОВСКИЙ ИВАР АЛФРЕДОВИЧ, ПУМПЕН ПАВЕЛ ПАВЛОВИЧ, ПУШКО ПЕТР МЕЧИСЛАВОВИЧ, ОЗОЛС ЮРИС АРВИДОВИЧ, ОСЕ ВЕЛТА ПЕТРОВНА, ЦИБИНОГИН ВЛАДИМИР ВИКТОРОВИЧ

МПК / Метки

МПК: C12N 15/51, C12N 15/70, C12N 1/21

Метки: кодирующая, днк, рекомбинантная, эпитопом, аминокислот, кор-антигенвируса, экспонированным, конструирования, бактерий, гепатита, штамм, плазмидная, поверхности, 1-55, лишенный, концевых

Опубликовано: 23.02.1992

Код ссылки

<a href="http://patents.su/5-1713930-rekombinantnaya-plazmidnaya-dnk-kodiruyushhaya-kor-antigenvirusa-gepatita-v-lishennyjj-dnk-39s-koncevykh-aminokislot-s-ehksponirovannym-na-ego-poverkhnosti-ehpitopom-pre-s-1-55-spo.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентов СССР">Рекомбинантная плазмидная днк, кодирующая кор-антигенвируса гепатита в, лишенный днк 39с концевых аминокислот с экспонированным на его поверхности эпитопом pre s 1-55, способ ее конструирования и штамм бактерий</a>

Похожие патенты