Штамм гибридных культивируемых клеток mus мusсulus l., используемый для получения моноклональных антител к м зависимой днказе хроматина печени крыс

Номер патента: 1808872

Авторы: Шапиро, Котляр, Махмутова, Хамаде, Винтер, Белова

Скачать ZIP архив.

Текст

(19) Ия ИЗОБ Т О ВИДЕТЕЛЬС К АВТОРСКО КРЪС (57) Ис ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОВЕДОМСТВО СССР(46) 15,04,93. Бюл. М (71) Казанский госуд тет им, В.И.Ульянова- (72) М,М,Белова, Л,Я ляр, Г.А.Шапиро, ф. (54) ШТАММ ГИБРИД МЫХ КЛЕТОК МОЯ М ЗУЕМЫЙ ДЛ МОНОКЛОНАЛЬНЪХ ВИСИМОЙ ДНКазе 14арственный универсиЛенина.Махмутова, Е,Ю,КотМ.Хамаде и В,Г,Винтер НЫХ КУЛЬТИВИРУЕОЯСО 1 ОЯИСПОЛЬЯ ПОЛУЧЕНИЯАНТИТЕЛ КМп -ЗАХРОМАТИНА ПЕЧЕНИ ьзование; биотехнология, молекуИзобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в молекулярной энзимологии, а также для получениягомогенных препаратов Мп -зависимой2+ДНКазы, хроматина печени крыс методомаффинной хроматографии,Штамм гибридных культивируемых клеток Мцз п)цзсццз . получают следующимобразом.В качестве доноров иммунных селезенок используют 8-12-недельных мышей линии ВаЬ/с, Мышей иммунизируютвнутрибрюшинно и подкожно нейтральнойМп -зависимой ДНКазой хроматина пече 2+ни крыс с удельной активностью 600 ед/мг,За три дня до гибридизации животным вводят высокоочищенный препарат фермента судельной активностью 2358 ед/мг, Культуруклеток миеломы мыши МЯ/1-А 9.4.1,. у,которой потеряна способность к синтезу собственных иммуноглобулинов, получают из 5)5 С 12 М 5/00, С 12 лярная энзимология, Сущность изобретения: получение штамма гибридных культивируемых клеток Мцз гпцзсццз продуцирующего моноклональные антитела (МКА) к Мп -зависимой ДНКазе хромэтина печени крысы, Штамм получают гидридизацией спленоцитов мышей линии ВаЬ/с и клеток миеломы ИЯ/1 - Ао 4.1, Титр МКА в культуральной жидкости, определенный с помощью иммуноферментного анализа, составляет 1:8, в асцитной - 1:10, МКА связы 5вают Мп -зависимую ДНКазу, при этом они способны ингибировать нуклеазную активность данного фермента, 2 табл,коллекции институа Цитологии А, СССР, - Клетки культивируют на "полноценной" среде следующего сос 1 ава; 1 литр исходной среды КРМ - 1640, 2 г йаНСОз, 110 мг пирувата натрия, 150, нативной эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ :глугамина, 10 мМ НЕРЕЯ, 50 мг гентамицина, 10 мМ 3-меркаптоэтанола, 5 10 ед/мл инсулина, Клетки. в течение трех недель выращивают на "полноценной" среде в присутствии 20 мкг/мл 8-азагуанина для освобождения от предшествующих ревертантов, За три. дня до гибридизации клетки переводят на "полноценную" среду без 8-азагуанина. Для гибридизации монослой миеломных клеток, находящихся в логарифмической фазе роста, смывают "полноценной" средой без сыворотки. Подсчет клеток ведут в камере Горяева. Количество жизнеспособных клеток определяют при окрашивании 0,50-ным раствором трипанового синего. Слияниеклеток миеломы с иммунными спленоцитами проводят по методу Келера и Милстейна с помощью полиэтиленгликоля, Селезенку иммунизированного животного промывают 2-3 раза "полноценной" средой без сыворотки и переносят в стеклянный гомогенизатор, Тремя осторожными давительными движениями получают суспензию клеток. После оседания крупных частиц собирают полученную суспензию клеток и смешивают с миеломными в соотношении 2 10 спленоцитов и 1 10 миеломных. Клетки осаж 7дают центрифугированием в течение 10 минут при 800 д. Затем по каплям добавляют 2 мл 50 оь-ного раствора полиэтиленгликоля (молекулярная масса 1540), приготовленного на "полноценной" среде, но без сыворотки и НЕРЕЯ. После мягкого перемешивания в течение минуты, приливают "полноценную." среду(50 мл) и центрифугируют 10 минут .при 800 9. Полученный осадок заливают "полноценной" средЬй. Суспенэию клеток оставляют на 12 часов в термостате. Затем "полноценную" среду заменяют на селективную среду НАТ - "полноценную" среду, содержащую 10 мол/л гипоксантина, 1,6 10 мол/л тимидина, 4 10 мол/л аминоптерина - и раскапывают в 96-луночные панели с питающим слоем, из перитонеальных макрофагов мыши. Клетки выращивают в 5%-ной атмосфере СО 2 при 37 С, На 14-ый день появляются первые колонии гибридом, супернатант этих лунок исследуют на присутствие моноклональных антител путем иммуноферментного анализа.Далее путем клонирования осуществляют выделение стабильных клонов гибридных клеток, Клетки из тех лунок, супернатант которых дает положительный результат в ИФА, используют для клонирования и реклонирования. Для этого клетки, находящиеся в середине логарифмической фазы роста, разводят свежей "полноценной" средой и рассевают в новую панель иэ расчета 1 клетка на лунку, Предварительно в эти панели рассевают питающие клетки. Клонирование проводят трехкратно, так, чо 60 оь клонов дают положительный ответ при исследовании методом ИФА. Клоны, дающие положительный результат в ИФА и ингибирующие активность ДНКазы в системе 1 п чсго, выращивают в сосудах Карреля. Полученный штамм обозначают 4 Е, он хранится в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР под номером 530 Д и характеризуется следующими признаками,Культуральные признаки,Среда ВРМ - 1640 с 10 О, телячьей эмб 5 риональной сыворотки, 2 мМ-глутамина,50 г/л гентамицина, 10 мМ 2-меркаптоэтанопа, 5 10 ед/мл инсулина. Клетки вырэ-зщивают при 37 С в 5%-ной атмосфере СО 2на стеклянной или пластиковой культураль"0 ной посуде. Посевная доза 5 10 кл/мл.Пассажи проводят каждые 2-3 дня с кратностью рассева 1;5. Для получения асцитнойжидкости 5-7 10 клеток вводят перитонибально мышам ВаЬ/с, сенсибилизированным пристаном, Опухоль развивается через7-10 дней.Криоконсервирование.Клетки штамма ресуспендируют в средеВРИ с 45 О/, эмбриональной телячьей сыворотки в присутствии 10% ДМСО,разливаютв пластиковые ампулы по 4-6 10 клеток в 1мл,Размораживание,Быстро при 37 С клетки разводят в 1025 мл полноценной среды и осаждают, ресуспендируют в 5 мл той же среды и переносятв культуральный флакон. Выживамость после размораживания более составляет более 30%.30 Контаминация,Бактерии и грибы в культуре не обнаружены при длительном наблюдении и посевах на питательные среды.Характеристика полезного продукта,Моноклональные антитела связывают2+Мп -зависимую ДНКазу, при этом они способны ингибировать нуклеазную активность данного фермента. Титр МКА вкультуральной жидкости, определенный с40 помощью ИФА, составляет 1:8, в асцитнойжидкости - 1.10,5П р и м е р 1, Для определения специфического взаимодействия моноклональ 2+ных антител с Мп -зависимой ДНКазойпроводят определение нуклеэзной активно 2+сти Мп -зависимой ДНКазы в присутствииантител, Нуклеазную активность определяют спектрофотометрически. В работе используют реакционную смесь следующегосостава (общий объем 200 мкл);100 мкг денатурированной нагреванием ДНК из тимуса теленка, 20 мМ трис НС буфера рН 7,2,25 мМ Мп . Во все пробы добавляют по 202+мкл препарата ДНКазы, инкубированной в55 течение 30 минут при 37 С с моноклонапьными антителами. Контролем служат пробы,где фермент инкубируют без антител, Затемреакционную смесь с ферментом инкчбируют при 37 С в течение часа, Реакцию оста5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 навливают добавлением 3,8 мл ЗоНС 10 на холоду. Осадок кислотнонерастворимых продуктов удаляют через 15 мин центрифугированием при 7000 о в течение 15 мин. В надосадочной жидкости прирост кислоторастворимых продуктов определяют на спектрофотометре по поглощению при 260 нм. За единицу активности фермента принимают изменение оптической плотности /Е 2 б 0/ реакционной смеси за 1 ч инкубации в пересчете на 1 мл ферментного препарата (ед/мл). Удельную активность определяют как отношение числа единиц активности ферментного препарата на количество мг белка (ед/мг). Активность фермента, инкубированного без антител, принимают за 100 о , а активность фермента, инкубированного в присутствии антител, пересчитывают в пропорции;100 о - активность фермента без антител (Е 2 бО)Х% - активность фермента с антителами (Е 2 бо)Полученные результаты представлены в табл.1,Для того, чтобы исключить возможность ошибки эксперимента при разведении фермента вследствие внесения в реакционную смесь дополнительного объема жидкости в виде антител, ставят следующие опыты: вместо исследуемых антител в реакционную смесь вносят антителэ клонов 5 А и 1 В, которые дают положительный ответ в ИФА при взаимодействии с ферментатом. Полученные данные тоже представлены в табл,1,Таким образом, результаты полученных исследований показывают, что только клон 4 Е является продуцентом антител, которые способны ингибировать активность фермента на 80%, Клоны 5 А и 1 В, которые дают высокий положительный ответ в ИФА, не способны ингибировать активность изучаемого фермента на 80%, даже при увеличении количества вносимых антител. По литературным данным большего процента ингибирования активности ферментов иммуноглобулинами достигнуть невозможно, Таким образом, из полученных гибридом только клон 4 Е отвечает поставленным требованиям - максимальной способностью ингибировать активность Мп -зависимой ДНКаэы,П р и м е р 2. Полученные моноклональные антитела используют для изучения иммунохимических свойств нуклеаз (эволюционная биохимия ферментов), В работе.используют ферменты различных эволюционных груп; Мп -зависимую ДНКаэу хроматина печени крыс с удельной активностью 2358 ед/мг; Сэ, Мо-зависимуюДНКазу ядер эмбрионов морского ежа с удельной активностью 1278 ед/мг; ДНКазу из ядер эмбрионов вьна с удельной активностью 416 ед/мг; панкреатическую ДНКазу с удельной активностью 4200 ед/мг по Кунитцу; панкреатическую РНКазу с удельной активностью 40 ед/мг по Кунитцу, а также бактериальные нуклеазы. РНКазу Вас,1 п 1 егтед 1 оз с удельной активностью 12000 ед/мг, и нуклеазу Бег.еагсезсепз с удельной активностью 1,5-2,0 10 ед/мг.бДля изучения взаимодействия моноклональных антител с различными ферментами применяют метод твердофазного ИФА, т,к. он обладает высокой чувствительностью и позволяет в одинаковых условиях провести анализ сотни проб, В качестве антигена в панель вносят ферменты в различных разведениях, а в качестве антител используют фракции моноклональных антител клона 4 Е в разведении 1:2000(концентрация антител1,1 мкг/мл).Моноклональные антитела разводят на 1%-ном БСА в буфере, содержащем 0,01 М трис-НС 1, 0,15 М МаС 1, 10 М ЭДТА, поскольку при разведении беэ БСА активность антител резко снижается,Результаты исследований представлены в табл,2,Как видно иэ таблицы, моноклональные антитела к Мп -зависимой ДНКазе хромэ 2+тина печени крыс связываются с этим ферментом; Сэ, Мо-зависимой ДНКазой ядер эмбрионов морского ежа, нуклеазой эмбрионов вьюна и РНКазой Вас 11 Ьз 1 п 1 еппеб 1 цз, но не связываются с панкреатической ДНКазой, нуклеазой Яег,пагсезсепз и панкреатической РНКазой, На основании полученных данных можно сделать вывод о наличии сходных антигенных детерминант у трех из семи исследованных ферментов,Способность моноклональных антител распознавать ферменты с высокой степенью специфичности используется для решения ряда проблем молекулярной генетики и эволюционной. биохимии, Интересно отметить, что в 60 ослучаев детальное изучение ферментов с помощью моноклональных антител показало, что последние существуют в мультимолекулярной форме. Можно предположить что изучаемый авторами фермент Мп -зависимая ДН Каза хроматинэ печени крыс существует в такой форме, Но этот вопрос еще подлежит дальнейшему изучению. Используя моноклональные антитела, можно проводить исследования в эволюционном плане, следя за появлением и изменением содержания изучаемого энтигена в клетке при развитии организма или клеточном цикле, наблюдая за миграцией антигена в,пределах клетки и всего организма.1808872 Таблица 1 бли Редактор В.Тр., бченк ставитель М.Серовахред М,Моргентал Корректор М,Петров Заказ 1258 Тираж Подписное ВНИЙПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ ССС 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 зводственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 10 ф о р м у л а и з о б р е т е н и я используемый для получения моноклональ 2+Штамм гибридных культивируемых кле- ных антител к Мп -зависимой ДНКазе хроток Моз возсияоз . ВСКК (П) М 530 Д, матинэ печени крыс.

Смотреть

Заявка

4926897, 09.04.1991

КАЗАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМ. В. И. УЛЬЯНОВА-ЛЕНИНА

БЕЛОВА МАРГАРИТА МИХАЙЛОВНА, МАХМУТОВА ЛЯЛЯ ЯГФАРОВНА, КОТЛЯР ЕЛЕНА ЮРЬЕВНА, ШАПИРО ГАЛИНА АРОНОВНА, ХАМАДЕ ФАДИЯ МУХАМЕД, ВИНТЕР ВИКТОР ГЕОРГИЕВИЧ

МПК / Метки

МПК: C12N 5/00, C12P 21/08

Метки: используемый, клеток, печени, хроматина, культивируемых, крыс, мusсulus, гибридных, моноклональных, днказе, антител, штамм, зависимой

Опубликовано: 15.04.1993

Код ссылки

<a href="http://patents.su/4-1808872-shtamm-gibridnykh-kultiviruemykh-kletok-mus-mussulus-l-ispolzuemyjj-dlya-polucheniya-monoklonalnykh-antitel-k-m-zavisimojj-dnkaze-khromatina-pecheni-krys.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентов СССР">Штамм гибридных культивируемых клеток mus мusсulus l., используемый для получения моноклональных антител к м зависимой днказе хроматина печени крыс</a>

Похожие патенты