Рекомбинантная плазмидная днк 36к-pvh, кодирующая синтез иммуногенного белка 36к вируса осповакцины штамма ливп, и штамм бактерий еsснеriснiа coli продуцент этого белка

Номер патента: 1661215

Авторы: Муравлев, Чешенко, Щелкунов, Малыгин, Рязанкина, Чикаев

Скачать ZIP архив.

Текст

.Я 2 16 б 1 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯПРИ ГКНТ СССР Е ИЗОБРЕТЕНИЯ ОПИ ЕЛЬСТВ(71) Всесоюзный научно-исследовательский институт молекулярной биологии Научнопроизводственного объединения "Вектор" (72) О.И,Рязанкина, А,И.Муравлев, Н,В.Чешенко, Н.А.Чикаев, С,Н.Щелкунов и Э.Г.МалыгинЧго, 1987, ч.61, М 11, о.3550-3554. (54) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДН К 36 К-рчН, КОДИРУЮЩАЯ СИНТЕЗ ИММУНОГЕННОГО БЕЛКА 36 К ВИРУСА ОСПОВАКЦИНЫ ШТАММА ЛИВП, И ШТАММ БАКТЕРИЙ ЕЯСНЕЯСНА СО- ПРОДУЦЕНТ ЭТОГО БЕЛКА(57) Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии Изобретение относится к биотехнологии и медицине, в частности может быть использовано для получения антисыворотки к иммуногенному белку, а также для тестирования антител, появляющихся при иммунизации вирусом осповакцины.Целью изобретения является создание штамма Е.со - продуцента иммунногенного белка 36 К вируса осповакцины штамма ЛИВП,дная ДНК вектора ген ас 2 с собстве ер которой 5725 и.ааааЪ омбинатная плазрующая химерный лактозидазы и вице. Плазмида 36 К- лок 36 К вируса ледующих элеменСконструи мида 36 К-рчН белок; состоя русного белка рчН, кодиру осповакцины с тов: рована ре зкспресси щий из ф-г на ее С-кон ющая бе остоит из с К АВТОРСКОМУ С)5 С 12 М 15/38, 1/20 и медицине. Целью изобретения является создание штамма Е.со - продуцента иммуногенного белка 36 К вируса осповакцины штамма ЛИВП. Сконструирована векторная плазмида 36 К-рчН, содержащая Ла-ген, обеспечивающий устойчивость к эмпициллину, и ген ас Л с собственным промотором. При трансформации клеток Е.со ВМН 71- 18 плазмидой 36 К-рчН получают штамм - продуцент химерного белка, который обладает вирусной антигенной специфичностью, связывается с антителами сыворотки крови от переболевших животных и может быть использован для диагностических целей. Химерный белок является иммуногенным. Штамм бактерий, содержащий плазмиду 36 К-рчН, задепонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов под номером В. 2 с.п. ф-лы, 1 табл. плазми рОВ 290, содержащего нным промотором, разм н. (мол.м, 3,8 МД);Нпс- Взрй- фрагмент плазмиды очН 64 с геном белка 36 К вируса осповакцины штамма ЛИВП, размер которого 1029 р,н. (мол. м. 0,69 МД);генетические маркеры - ген устойчивости к амициллину, ген ас Е и ген белка 36 К ВОВ, Размер плазмиды 36 К-рчН равен 6754 и н (мол м 4 5 МД)Получен штамм ЕзсЬегсЬа со ВКПМ В 4743 - продуцент иммуногенного белка 36 К вируса осповакцины штамма ЛИПВ.Полученный штамм характеризуется следующими признаками, 1661215Морфологические признаки.Клетки и рямые, палочковидной формы сразмерами 1,2 - 1,6 х 2 - 6 мкм, подвижные сперитрихиальными жгутиками, грамотрицател ьные, неспороносные.Культуральные признаки,Клетки хорошо растут на простых питательных средах, оптимальная температурароста 30 - 37 С, рН 6,8 - 7,5, При росте намясопетонном и рыбном агаре развиваютсяв виде гладких, круглых, блестящих, серых,мутных колоний с ровными краями, При ро, сте в жидких средах вызывают равномерноепомутнение с образованием осадка.Физиолого-биохимические признаки,Клетки растут в интервале температуре4-45 С, желатин не разжижают, восстанавливают нитраты и нитриты, В качестве источника углерода используют многиеуглевоцы и аминокислоты, В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной и нитратной формах; так иорганические соединения в виде пептона иаминокислот.Устойчивость к антибиотикам.Штамм проявляет устойчивость к ампициллину, обусловленную наличием рекомбинантной плазмиды,Стабильность плазмиды в штамме,При поддержании штамма в течение 2летка рыбном агаре при 4 С или в 30-номглицерине при -70 С в присутствии ампициллина не наблюдается перестройки илиутери плазмиды.Штамм депонирован во Всесоюзнойколлекции промышленных микроорганизмов института "ВНИИгенетика" под номером ВКПМ В.П р и м е р 1, Получение штамма бактерий - продуцента белка 36 К вируса осповакцины.Клетки бактерий Е,со ВМН 71-18, содержащие плазмидную ДНК рчН 290, иклетки бактерий Е,со НВ 101, содержащиеплазмидную ДНК рчН 64, выращивают в 0,5л бульона с ампициллином в концентрации40 мкг/мл до титра 5 х 10 кл/мл и пРоводятамплификацию плазмиды в течение ночи.Клетки осаждают центрифугированием(50009, 5 мин, 4 С) и выделяют из них плазмидную ДНК.Полученные препараты ДНК плазмидр 0 й 290 и рчН 64 используют для конструирования плазмиды 36 К - рчН, которое проводят следующим образом.Осуществляют неполный гидролиз 120мкг ДНК рОВ 290 эндонуклеазой рестрикции Са 1 в буфере А 50 мМ трис НС, рН 7,6;50 мМ МаС; 10 мМ МяС 2; 1 мМ 2-меркаптоэтанол) и электроэлюируют линейную форму плазмиды на диализную мембрану, Выход линейной формы ДНК составляет10 , от суммарного количества гидролизован ной ДН К. В ыступающие "липкие" кон 5 цы достраивают до "тупых" фрагментомКленова ДНК-полимеразы, Затем ДНК гидролизуют эндонуклеазой рестрикции Нпдв буфере А и электроэл юируют на диализную мембрану фрагмент 5720 п.н.10 Для выделения индивидуального генабелка 36 К 20 мкг ДНК плазмиды рчН 64,содержащей Нпб -Р, фрагмент вируса осповакцины инкубируют с эндонуклеазамирестрикции Нпди Взр Я в буфере А и15 электроэлюируют на диализную мембрануфрагмент 1029 п.н,Полученные препараты ДНК вектора ифрагмента смешивают в соотношении 1:10в буфере В (66 мМ трис НС, рН 7 5; 6 5 мМ20 М 9 С 2, 10 мМ дитиотрейтол; 0,4 мМ АТФ) спомощью ДНК-лигазы фага Т 4(72 ед/мкл) иэрасчета 1 мкл фермента на 50 мкг ДНК.Инкубируют 16 - 20 ч при 4 С. Полученнуюсмесь плазмид используют для трансформа 25 ции клеток Е,со ВМН 71-18. Трансформированные клетки высевают наагаризованную средуВ с ампициллином(40 мкг/мл) и растят 24 ч при 37 С.Клоны, содержащие рекомбинатную30 плазмидную ДНК с геном белка 36 К, отбирают с помощью гибридизации и з 1 ц с Рзондом, приготовленным на основеНпб- Вар В фрагмента 1020 п.н. Иэклеток клонов, дающих положительный от 35 вет в гибридизации с Р-зондом, выделяют32плазмидную ДНК, обозначенную 36 К-рчН,содержащую в своем составе фрагмент вирусной ДНК 1029 п.н. с геном белка 36 К,Анализ совпадения рамок трансляции40 гена ас 7 и гена белка 36 К в клонах, содержащих рекомбинатную плазмидную ДНК,осуществляют с помощью доказательствасинтеза этими клонами химерного белка смол, м. 145 - 150 КД, Для этого клетки из45 отдельных клонов, дающих положительныйответ в реакции гибридизации с Р-зондом,32высевают в 5 мл .В, содержащего 40 мкг/млампициллина, и растят в течение 16 ч. Затем0,35 мл ночной культуры вносят в 0,5 мл50 свежего ЬВ, содержащего 40 мкг/мл ампициллина, растят до плотности суспензии0,6-0,7 ОЕ/мл при 600 нм и добавляют изопропил-ф-Д-тиогалактопиранозид(ИПТГ) доконцентрации 0,001 М для индукции синтеза55 В-галактозидазы, Клетки растят еще 4 ч доплотности 1,7 ОЕ/мл при 600 нм, осаждаютцентрифугированием (50009, 5 мин, 4 С ).осадок ресуспендируют в 5 мл физиологического раствора (0,15 М ИаС) и снова осаж 1661215510 15 20 25 30 35 40 45 5055 дают центрифугированием, Для получения лизата клеток осадок ресуспендируют в 0,4 мл 10 мМ трис НС 1, рН 8, добавляют 1 мг лизоцима в 0,1 мл 10 мМ трис НС 1, рН 8 и выдерживают 20 мин, Затем озвучивают 5 раз по 20 с во льду,Анализ синтезируемых клетками белков осуществляют с помощью электрофореза в прерывистой буферной системе в 8 О ДДС - ПААГ 10 кмл лизата клеток. После окраски белков 0,25 ф Кумасси в 50;-ном спирте с 70, уксусной кислоты гель отмывают 2 - 16 ч в 20 О-ном спирте с 7 О уксусной кислоты.Результаты проведенного анализа показывают, что отобранные клоны при выращивании на среде с ИПТГ синтезируют белок с мол. м,"145 - 150 КД, Следовательно, встройку гена белка 35 К в векторную плазмиду рОЯ 290 осуществляют так, что рамки трансляции генов 1 ас 7 и белка 36 К совпадают, так как согласно первичной структуре Н 1 пд 111 - Р фрагмента при несовпадении рамок трансляции происходит терминация синтеза белка в начале встроенного фрагмента, Таким образом, получают бактериальный продуцент белка 36 К вируса осповакцины, обозначенный Е.со 1 В М Н/36 К-рч Н.Анализ генетических маркеров в плазмиде проводят следующим образом.Резистентнось к ампициллину клеток штамма Е.соИ ВМН/36 К-рчН, содержащих плазмиду 36 К-рчН, анализируют на агаризованной среде с содержанием ампициллина 10 - 100 мкг/мл, Данные клетки растут на средах с этой концентрацией ампициллина.Наличие в клетках, содержащих плазмиду 36 К-рчН, химерного белка устанавливают по окрашиванию колоний Е.со 11, содержащих эту плазмиду, в синий цвет на агаризованной среде с 0,05 мг/мл 5-бромо-хлоро-индзоксил-Д-галактопиранозида (Хца) и 10 М ИПТГ.Наличие в клетках Е.со, содержащих плазмиду 36 К-рчН, белка 36 К вируса осповакцины, который входит в состав химерного белка, устанавливают по связыванию вирусоспецифической лапинной антисыворотки (ЛА), полученной в результате развития у кролика инфекционного процесса; а также антисыворотки, полученной к мембранам клеток СЧ, инфицированных вирусом осповакцины (анти М), с лизатами клеток Е,соИ из отдельных клонов в реакции радиоиммуноанализа.В качестве контроля используют сыворотку неимунного животного (НКС). В качестве отрицательного контроля антигена используют лизат Е со 1, содержащий вместо химерного белка 3- галактозидазу(р - гал).в качестве положительного контроля - тот же лизат с добавлением КРфракции вируса осповакцины ( Р-гал + МР),Результаты представлены в виде счетов радиоактивности (имп/мин), Приведены средние значения результатов двух повторов. Разведения антисывороток 1:50.Результаты анализа, представленные в таблице, свидетельствуют о том, что экспрессирующийся химерный белок обладает вирусной антигенной специфичностью, Лапинная антисыворотка, полученная в результате развития у кролика инфекционного процесса, содержит антитела, связывающиеся с химерным белком. Исследуемый белок, по-видимому, входит в состав мембран инфицированных клеток, так как связывается с антителами, содержащимися в сыворотке к мембранам клеток, инфицированныхвирусом.П р и м е р 2. Иммуногенные свойства белка 36 К в составе химерного белка,Получают моноспецифические антисыворотки к химерному белку (мол. мас.145 - 150 КД), который появляется в лизате клеток Е,со, трансформированных рекомбинатной плазмидой 36 К-рчН, а также кР- галактозидазе, полученной из лизатов клеток Е,со 11, трансформированных исходной плазмидой рОВ 290.Полученные антисыворотки реагируют в РИА с бактериальными лизатами, содержащими химерный белок, показывая титры1: 100, Антисыворотка, полученная к химерному белку в РИА не реагирует с оболочкой и сердцевиной вируса, но реагирует с лиза- тами и мембранами инфицированных клеток.Для идентификации продукта гена 36 К проводят радиоиммуноблотинг различныхфракций вируса осповакцины, лизатов и мембран инфицированных и неинфицированных клеток счс антисывороткой к химерному белку.По радиоавтографу определяют, чтоданная антисыворотка связывается с белком с мол. м. 36 КД, содержащимся в лизатах и мембранах инфицированных клеток, и не связывается с различными фракциями вируса. Наблюдается незначительное не- специфическое связывание с сердцевинными белками вируса в области 62 и 58 КД. Это свидетельствует о том, что химерный блок является иммуногенным и обладает вирусной специфичностью.Таким образом, изобретение позволяетполучить иммуногенный вирусный белок 36 К, который может быть использован для1661215 Составитель Т. Забойкинаактор М. Стрельникова Техред М;Моргентал Коррект рол Заказ 2097 ВНИИПИ Гос Тираж Подписноественного комитета по изобретениям и открытиям 113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 ГКНТ С Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Га 101 получения антисыворотки к этому белку, атакже для тестирования антител, появляющихся при иммунизации вирусом осповакцины. Формула изобретения 1. Рекомбинантная плазмидная ДН К 36 К- рчН, кодирующая синтез иммуногенного белка 36 К вируса осповакцины штамма ЛИВП, размером 6754 п.н, и мол,м, 4,5 МД, содержащая Са- Нпб- фрагмент вектора рОЙ 290 размером 5725 п.н. и мол. м.3,8 МД, НпО- Вар В - фрагмент ДНК вируса осповакцины с геном белка 36 К размеромм 1029 п.н, и мол.м. 0,69 МД; сайты для эндонуклеаз рестрикции:по три участка расщепления рестриктазы ЕсЯ, Са ,два участка расщепления рестрикта 5 ции Ваа Н,по одному участку расщепления рестриктаэ Нпб , Рэт , Яа ,генетические маркеры:- Ар"- ген устойчивости к ампициллину;10 - ас 2 - ген 3-галактозидазы. 2, Штамм бактерий ЕзсЪегсЫа соВКПМ В- продуцент иммуногенного белка 36 К вируса осповакцины штамма 15 ЛИВП.

Смотреть

Заявка

4719264, 14.07.1989

ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ НАУЧНО-ПРОИЗВОДСТВЕННОГО ОБЪЕДИНЕНИЯ "ВЕКТОР"

РЯЗАНКИНА ОЛЬГА ИЛЛАРИОНОВНА, МУРАВЛЕВ АЛЕКСАНДР ИВАНОВИЧ, ЧЕШЕНКО НАТАЛИЯ ВИКТОРОВНА, ЧИКАЕВ НИКОЛАЙ АНДРЕЕВИЧ, ЩЕЛКУНОВ СЕРГЕЙ НИКОЛАЕВИЧ, МАЛЫГИН ЭРНСТ ГЕОРГИЕВИЧ

МПК / Метки

МПК: C12N 15/38, C12N 1/20

Метки: бактерий, штамма, кодирующая, вируса, белка, 36к-pvh, продуцент, штамм, осповакцины, рекомбинантная, днк, еsснеriснiа, плазмидная, этого, иммуногенного, ливп, синтез

Опубликовано: 07.07.1991

Код ссылки

<a href="http://patents.su/4-1661215-rekombinantnaya-plazmidnaya-dnk-36k-pvh-kodiruyushhaya-sintez-immunogennogo-belka-36k-virusa-ospovakciny-shtamma-livp-i-shtamm-bakterijj-essnerisnia-coli-producent-ehtogo-belka.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентов СССР">Рекомбинантная плазмидная днк 36к-pvh, кодирующая синтез иммуногенного белка 36к вируса осповакцины штамма ливп, и штамм бактерий еsснеriснiа coli продуцент этого белка</a>

Похожие патенты