Штамм вируса геморрагической лихорадки с почечным синдромом 1-го серотипа, используемый для специфической лабораторной диагностики

Номер патента: 1319555

Авторы: Слонова, Астахова, Косой, Ткаченко, Дзагурова

Скачать ZIP архив.

Текст

Н А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ нится в Государственной коллекции вирусов Института вирусологии им.Д.И.Ивановского под М ГКВи характеризуется следующими признаками.При электронно-микроскопическом изучении инфицированных клеток 7 ЕКО-Е 6выявляются частицы округлой формы сдиаметром около 10 нм, окруженные липопротеиновой оболочкой. Вирус размножается в культуре клеток ЧЕКО-Е 6при 37 С, рН 72-78, множественностьзаражения составляет не менее 0,1 вирусной частицы на клетку, максимальный титр вируса обнаруживается на12-14 день после заражения и составляет 40-45 1 о 8 ПР, /мл. В крови эа- фраженных животных с 10 дня после заражения накапливаются специфическиеантитела к вирусу ГЛПС, для выявления которых исследуемые сывороткикрови больных людей наносят на предметные стеклас антигеном вируса"Уссури". Основанием для постановки лабораторного диагноза служатрезультаты метода флуоресцирующихантител, указывающие на четырехкратное или более значительное нарастание титров специфических антител квирусу ГЛПС во вторых сыворотках.1 табл ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ(71) Институт эпидемиологии и микробиологии СО АМН СССР и Институт полиомиелита и вирусных энцеФалитовАМН СССР(54) ШТАММ ВИРУСА ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙЛИХОРАДКИ С ПОЧЕЧНЫМ СИНДРОМОМ 1-ГОСЕРОТИПА, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ(57) Изобретение относится к вирусологии и может быть использовано длялабораторной диагностики геморрагической лихорадки с почечным синдромом(ГЛПС). Целью изобретения является-получение нового штамма вируса геморрагической лихорадки с почечным синдромом 1-го серотипа. ШТамм Уссури 4590. вйруса ГЛПС получают путем последовательного пассирования суспенэиилегочной ткани восточно-азиатскойлесной мьппи, отловленной в природномочаге ГЛПС в Приморском крае, накультуре клеток 1/ЕКО-Е 6. Штамм хра 7/00, Л 61 К 39/122 И 7/00, С 12 К 1;91)13ИзОбретОтосте 5 к Би)Усоз 0гии и может быт. Испо)ьзовО дпясцецц 4 н 1 есной лабораторной диагностики геморрдгцческай лихорадки с почечным сицдрочол цд Пальцем ВостокеСССР,Целью изобретения является цолучение нового. штамма вируса геморрдгической лихорадки с почечцьм сицдромом (Г 1 С) 1-го серотипа.Штамл получают следующим образом,Используют легочную ткань самцавосточно-азидтскои мыши в возрасте8-10 месяцев,Перед исследо.дипел легкие триждыотмывают в физиологическом растворе(250 лкг/лл) и кдцямцзц (500 ел 5 лл).Затем легкие почещдют в стерильнуюступку и тщательно растирают в присутствии небольшого количества стерильОГО пес. )1 Обс 1)л 5 ют физ 0)оги -ческий раствор с 2;: цормдлцой телячьей сьворот;и и ) тдкого рдс етд;чтобь получитьО:-ну 1 о суспецзиюлегочной ткл 5 (дмг легких добдц -ляют сООтзетстцеццо 1,О мл )ИэиоОГИческого раствора), .его цуо суспецзно отсасывают стерильной пипеткой,переносят в иу 10 з 5 флаконцецтрцфугируют ир 6,000 Об/ли гтечение 30 лиц. Ндлосддочцуо жидкостОсторожно цзцлкают 1 Используют длязаражения клетогцои кугьтуры.Для заря)ке5 ипользуют клеткиЧЕРО-Еб, которь зырящшздют в 50 млфлаконах до образования полного монослоя. Осветленную 10 Е - цую суспенэию легочнои ткани вносят в 4 флаконапо 0,2 мл в каждый, После контактаинокулята с клеткамипри 37 С в течение 40 мин моцослой клеток дваждыотмывазот средои 1 глд и Во Флаконыдобавляют среур для поддержания ростаклеток (среда Игла 2-1 ЕМ с 2 Е нормальной телячьей сыворотки). Инкубировацие инфицированных культур клеоток проводят при 37 С,Через 12 дней с момента инокуляции клеток культурдльцуо жидкость сливают, клеточный монослой дважды отмывают раствором Хецкса и обрабатывают последовательно 0,25 Х-ны раствором трипсина (2 мл нд Флакон) и 0,027-ым раствором версецд (2 мл цд флакон) по 2 мин кджзьл. После удаления версеца Флаконы с клетками инкубируют 19555црц 37 оС до цдяЗЛЕИИВ Прц)цдКО рд. -РЫХЛЕЦИЯ ЛОЦОСЛОЯ. ЗатЕИ зо ФЛДКОЦЬлобдцляют 1 мл свежей цитдтельцоисреды с 107. норлязь 0 ельеис Воротки (НТС) и прозолят в этом объев суспецлировдцие кзеток. Взвесьинфицированных клеток в объеме 0,2 млсмешивают с равным объелол суспецзиисвежих нормальных клеток ЧЕРО-Е 6,обеспечивая необходимую концентрациюклеточной суспензии (50 ООО -60 000клеток в 1.мл) добавлением среды ИглаМЕГ с 107 НТС, Через 2 суток инкубирования при 37"С во Флаконах эаменяют среду роста нд среду полдержация роста клеток и продолжают инкубирзвать клетки при 37 С в течение еще10 дней. Субкультцвирондние инфицированных клеток ЧЕРО-Е 6 проводят в дальнейшем по аналогичной методике с12-дцевцым интервалом.Начиная со 2-го пасс;зжд, часть инфицированных клеток наносят ца предо четные стекла и исследуют методом Фокусируощих днтител (МФА) цд присутстзие специфического днтигеня вирусаГЛПС. На уровне 2-го пассажа специфическоее свечение днтигенд вируса 30 ГПС обнаруживается линь В единичныхклетках. Отмечается цитаплдзматическдя локализация ацтигенд вируса ГПС,промунествеццо в перинуклеа)ной зоне ицфцировяцных клеток. По мере 35 ял;цтдции вируса в пассажах наблюдается Образование более крупных гранул, которые равномерно заполняют всюцитоплазму клеток. СпециФическое свечецие определяется кдк ярко-зеленая 40 люмицесценция на Фоне непораженныхклеток кирпичного цвета, Количестводнтигениоложительцых клеток заметновозрастает от пассажа к пассажу и составляет 90-100 к 5-6 пассажу, Ци топатического эффекта в инфицированных культурах не отмечается в течение Всего периода наблюдения. Нд уровне 6 пассажа суспензии инфицированных клеток разливают по 0,5 мл во флакоць 50 и хранят при минус 60 С, В дальнейшем эти суспензии используют в качестве посевного вируса и обозначаюткдк штамм "Уссури 4590".55 Тамм "Уссури 4590" хранится в Государственной коллекцш вирусов Института вирусологии ил. 1,И.Ивановского ИН СССР подКБи характеризуетсн следуошими п;)изцдками.1195 ГЬрфсиотчтстст.кц пртзцлкц.При электрона-микроскопическом изучецит клеток ЕЕО-Еб, ццфпцирова- цых штаммом "Уссури" вируса ГЛ 110, выявляются чдстицы округлой и.ти 5 овдльттай формы с птдметрам в среднем 100 цм, окруженные хороша контурирующейся липопротеицавой оболочкой. Морфология частиц сходна с таковой вирусов семейства Буньявирттде. 10Культуральцые признаки.Оптимальная множественцасть заражения клеток ЧЕКО-Еб штаммом "Уссури 4590" составляет не менее О, 1 вирусной частицы ца клетку, Оптималь ной температурой рлзмножеция штамма является 37.С. Бирус стабилен в интервале рН 7,2-7,8.Максимальный титр вируса в инфицированных клетках обнаружигдется на 20 12-14 день после заражения и составляет 4,0-4,5 1 оп 110,/ттл. и тттм 1)ам .Для заражения врусам ГЛПС (штаммУссури) используют суспецзиюклеток ЕКО-Еб. После вцесения вируссодержащей суспецзии во флаконысо взвесью клеток их помещают в термастат при 37 С. Культивирование вируса ГЛПС в клетках осуществляют втечение 12-14 суток.Пл 12 - 14 сутки с начлд ицфицировация клеток ЧЕЕО-Еб вирусам ГЛПС латтаслой клеток последовательно абрдбдтывлют раствором трнпсинл и версенл, после чего проводят суспендиравдние инфицированных клеток в ебапьшом количестве физиологического раствора, Коцечттдя коитецтрдцття клсток лалжцд составлять 300-400 тысяч в 1 мл.Йтлттогичттым образом готовят сусттензию тормальтсцсх цеинфиццрованных клеток т 7 ЕКО-Е 6, Суспензии ттнфттцттраванных и цармд.стьв тх клеток смешивают в равных абъемдх и раскапывают на предметные стекла а 3-5 мкл нд каждый мазок. После поднога высыхация суспецзий препараты фиксируют в охлажденцом ацетоне в течение 15-20 мин и затем абрабатывлют ультрафиолетовым облучением для иактивации инфекционной активности вируса, Приготовленные таким образом ацтигенные прелараты по использования хранят при минус 60 С. Итфектионттые призндтси,При введении штамма "Уссури 4590"вируса ГЛПС лдбардтарцым животным(вэрослье белые мыши, белые крысы,морские свинки, кролики) клиническихпроявлений заболевания и их гибелине обнаруживается в течение всегосрока наблюдения за животными (да 3-хмесяцев с момента инакулирандттия вируса) . Вместе с тем, начиная с 10 дняпосле заражения в их крови обнаружи, вается накопление специфических ан - 35тител к вирусу ГЛПС. Оптимум накопления антител определяется к 25-.30 дцюс момента их заражения. Таким образом; экспериментальные животные могут быть использованы для итмунизации и получения иммунных антиГЛПСсывороток, но не для пдссиравания животного .вируса,Для выявления специфических антител к вирусу ГЛПС исследуемые сыворотки крови больных людей наносят напредметные стекла с дцтигеном вирусаГЛПС, Сыворотки обследуют в Г 1 ФА вразведениях 1: 16 и выше,Препараты помещают во влажную камеру и выдерживают при 3С в течение 30 мин и затем стекла 3-кратнопромывают 0,01 Г 1 фасфлтцым буфернымраствором и сушат при комнатной температуре. На препараты наносят люминесцирующую сыворотку против глобулинов человекд в рабочем разведении,которое определяют и предварительномопыте. Б качестве коцтрастера используют раствор Голубого Эванса в конеч -ной концентрации 110 000, Препаратывновь ицскубируют ва влажной камере Полная инактивация инфекционной активности сптамма "Уссури 4590" вируса ГЛПС происходит при его нагревании при 60.С в течение 30 мин и при об - работке ультрафиолетовым облучением . (бактерицидные лампы) в течение 2 ч. Антигенная активность в первом случае снижается в 4 раза, а во втором случае остается без изменения,Храт;еттие вирусного штамма осуществляется в виде суспецзии инфицированных клеток тсЕКО-Еб с добавлением 5 ЕОНТС при минус 60 С, При таком режиме хранения вирусньпт штамм не теряет своей инфекционной и антигенной ак 55 4тцвцости в геецио 1 гада (срак цдбпюГ( сття)11 с аль з ов днне штлммд "Усг урц-"590" для сцетифичегкай ллбстраторцай диагностик ттчлюстрцруется следуюсим1319555 Продолжение таблицы4 9 Сыворотка кровибольных ГЛПС еньолез итры антител МФА с антиеном штамма Уссури" 842 (Уфа) 14:28 022 (Хабаровск) 2 16 5 1: 128 1: 409 00047 (Корея) 1024 Титры антителв МФА с антигеном штамма:3 1:6 Составитель М,СероТехред Л. Олийнык Корректор М.Демчи Редактор А,Купряк аж 494, П енного комитета ССС тений и открытий35, Раушская наб каз 249 Ти ВНИИПИ Государств по .делам изобре 1 13035, Москва, Ж дписное 4/5 Производственно-полиграфическое предприятие, г, Ужгород, ул. Проектная 5при 37 С в течение 30 мин, затем ихпромывают, высушивают и регистрируютс помощью люминесцентного микроскопа.Для вируса ГЛПС характерна локализация фпуоресцирующего антигена с .четкой гранулярной структурой в цитоплазме клеток. Яркое изумрудно-зеленое грануляпное свечение антигена вируса ГЛП просматривают ца фоне кирпичного,дйрашивация структуры нормальных нейкфицированных клеток Такой же кирпично-красный фоц отмечаюти на ка 4 ках с нормальной сывороткой,используемой в качестве контроля.Титром сыворотки считают ее наивысшееразведение, способное еще выявлятьспецифический антигец вируса ГЛПС.Для постановки серологического диагноза обследуют две сыворотки кровиот каждого больного. Первую сывороткуполучают тотчас же после выявлениязаболевания а вторую - через 3-5дней после забора первой. Основаниемдля постановки лабораторного диагноза служат результаты МФА, указывающие на четырехкратцое или более значительное нарастание титров специфических антител к вирусу ГЛПС во вторых сыворотках. Результаты исследова. ний представлець в .таблице,Штамм вируса геморрагической лихо.радки с почечным синдромом 1-го серо типа ГКВ У 710 (Государственная коллекция вирусов Института вирусологии им, Д;И.Ивановского АМН СССР), ис О польэуемый для специфической лабораторной диагностики.

Смотреть

Заявка

3944307, 14.08.1985

ИНСТИТУТ ЭПИДЕМИОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ СО АМН СССР, ИНСТИТУТ ПОЛИОМИЕЛИТА И ВИРУСНЫХ ЭНЦЕФАЛИТОВ АМН СССР

СЛОНОВА Р. А, АСТАХОВА Т. И, КОСОЙ М. Е, ТКАЧЕНКО Е. А, ДЗАГУРОВА Т. К

МПК / Метки

МПК: C12N 7/00, A61K 39/12

Метки: используемый, штамм, почечным, лихорадки, серотипа, диагностики, вируса, 1-го, специфической, лабораторной, геморрагической, синдромом

Опубликовано: 30.07.1990

Код ссылки

<a href="http://patents.su/4-1319555-shtamm-virusa-gemorragicheskojj-likhoradki-s-pochechnym-sindromom-1-go-serotipa-ispolzuemyjj-dlya-specificheskojj-laboratornojj-diagnostiki.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентов СССР">Штамм вируса геморрагической лихорадки с почечным синдромом 1-го серотипа, используемый для специфической лабораторной диагностики</a>

Похожие патенты