Способ подготовки препаратов бактериальных клеток к электронно-микроскопическому исследованию

Номер патента: 1174380

Авторы: Герасимов, Камынин

Скачать ZIP архив.

Текст

)4 СО ОС ТЕНИ ВИДЕТЕЛЬСТВ К АВТОРСНО 3481 557/211. 08. 8223. 08. 85.В.Н. ГерасиВсесоюзныкий инстит(21) (22) (46) (72) Бюл, Р 31мов и А,Н.Канаучно-исслт прикладной оовакр ель сщаяЖ 1 го 138 Егогеп.М. Во ДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ ПИСАНИЕ ИЗ логии(56) Кугеч А.К. ег а 1,Егорегоясоре е 1 есггоп 1 ре йе р 1 асопгепапГ Йе е асЫе Йе яохпие 1 е 8 ое, 2. Багцгйогсй.,1958, 597.Моог Н. Р 1 пе яггцсгиге 1егсЬей Беаяг се 1 ея. ЯоигЬо 11 о 83.са, 1963, 17. 609. 801174380(54)(57) СПОСОБ ПОДГОТОВКИ ПРЕПАРАТОВ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК К ЭЛЕКТРОННО-МИКРОСКОПИЧЕСКОМУ ИССЛЕДОВАНИЮпутем пропитывания образцов, замораживания, скалывания и репликации склотых поверхностей, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью предупреждения изменений ультраструктурысухих водорастворимых препаратов,пропитывание проводят в 1 Х-номрастворе формвара на дихлорэтане втечение 5-10 мин, а замораживаниеи скалывание ведут при температуре от в 1 до в 1 С.Изобретение относится к микробиологии, в частности к исследованию водорастворимых биопрепаратов в обезвоженном состоянии электронной микроскопией, и может быть использовано для ультраструктурного ана" лиза высушенных и лиофилиэированных тканей и клеток, бактерий и бактериальных вакцин, вирусов и вирусных вакцин в обезвоженном состоянии 10 (в анабиозе).Цель изобретения - предупреждение изменений ультраструктуры сухих водорастворимых препаратов.Способ осуществляют следующим 15 образом.Препарат бактериальной клетки пропитывают в 1 -ном растворе форм- вара на дихлорэтане в течение 5- 1 О мин, полученную суспензию наносят на плашку и замораживают в жидком фреоне, охлажденном жидким азо, том, в течение 5 с, затем препарат переносят в жидкий азот для окончательного замораживания. Замороженный препарат скалывают на охлажденном столике при температуре от в 1 до -170 С в вакуумно-эамара - 6 живающей установке (2 х 10 хогг).На сколотуюповерхность образцана- З 0 пыляют платину из катодной пушки в течение 8 с, и укрепляют углеродом в течение 15 с, Реплику снимают с поверхности образца в 40%-ном водном растворе хромовой кислоты в течение 35 24 ч. Затем реплику промывают дважды в бидистиллированной воде по20 мин каждый раз. Далее реплики монтируют на медные электронномикроскопические сеточки и изучают их в электронном микроскопе.В таблице представлены результаты криофрактографического анализа сухих водорастворимых биопрепаратов, препарированных по данному способу, 45Плоскость скола проходит через частицы биопрепарата или их естественные поверхностиБиопрепарат состоит иэ частиц округлой или овальной форы, отдельные частицы биопрепарата(при мерно 10) имеют диаметр 13,0-20,0 мкм, В частицах биопрепарата выявляют клетки биоагента равномерно распреде ленные в защитной среде. На такихl сколах также можно исследовать ульт- Я раструктурную топографию бактериальных клеток в биопрепарате. Клетки сжаты и имеют длину 1,1-1,5 мкм, ширина .0,15-0,24 мкм. Цитоплазма клетки имеет гранулярно-фибриллярное строение. В результате прохождения плоскости скола через мембраны бак" терии на криофрактограммах выявляют выпуклую (РР) и вогнутую (ЕР) поверх" ности внешней и цитоплаэматической мембран, На РР-поверхности внешней и цитоплазматической мембран обнаруживаются глобулярные (полиферментные) частицы, Таким образом, препарирование предлагаемым способом обеспечивает полную сохранность ультра- структурной организации биопрепаратов. На криофрактограммах, полу - ченных таким способом, можно провести фракционно-дисперсный анализ био,препаратов, т.е, определить форму, размеры и количественное распределение частиц биопрепарата по размерам. Способ также позволяет исследовать характер распределения клеток биоагента в частицах препарата. На таких криофрактограммах также можно исследовать ультраструктурную топографию мембран и клеток биопрепарата.П р и м е р 1, Для исследования используют два сухих водорастворимых биопрепарата. БиопРепаРаты (2 мг )пропитывают в течение 1 мин в 0,2 мл 1 -ного раствора формвара на дихлорэтане. Полученную суспензию наносят на металлическую плашку и эамораживают в жидком фреоне, охлажденном жидким азотом в течение 5 с, затем образец переносят в жидкий азот для окончательного замораживания. Замороженный образец скалывают на охлажденном столике (-170 С ) в вакуумно-замораживающей установке .(2 х х 10 хогг ). Реплику препарируют, как описанным способом.П р и м е р 2. Биопрепараты (2 мг 1, указанные в примерах 1 и 2, пропитывают в течение 1 О мин в 0,2 мл 1 -ного раствора формвара на дихлорэтане. Затем суспензию наносят на металлическую плашку и замораживают в жидком фреонена охлажденном столике ( в 1 С ) в вакуумнозамораживающей установке ( 2 х-6х 1 О хогг ). Дальнейшее препарирование реплик производят аналогично описанномуП р и м е р 3, Сухие водораство: римые биопрепараты, указанные в примере 1, по 2 мг каждый, пропитывают в течение 5 с, 1 и 1 О мин в1174380 51 О з0,2 мп 17.-ного раствора формвара надихлорэтане. Полученные суспензиинаносят на металлические плашки изамораживают в жидком фреонев течение 5 с, затем переносят в жидкийазот для окончательного замораживания. Замороженные образцы скалывают на охлажденном столике при-160 С в вакуумно-замораживающейустановке (2 х 10 хогг ). Реплики- 6с поверхности сколов указанных образцов препарируют аналогично,П р и м е р 4. Исследуемые биопрепараты по 2 мг каждый пропитывают в 0,2 мл 1%-ного раствора формвара на дихлорэтане в течение 5 с,1 и 10 мин. Полученные суспензии наносят на поддерживающие диски и замораживают в жидком фреоне-. 22, охлажденном жидким азотом, в течение5 с, затем переносят в жидкий азотдля окончательного замораживания.Замороженные образцы скалывают наохлажденном столике при - 150 С ввакуумно-замораживающей установке(2 х 1 О хогг ). Реплики препарируют аналогично описанному,Электронно-микроскопический анализ реплик с поверхности сколовсухих водорастворимых биопрепара -тов показывает, что при пропитывании биопрепаратов в 17.-ном раствореформвара на дихлорэтане в течение5 с, 1 и 10 мин и скалывании ввакуумно-замораживающей установке( 2 10 хогг ) при температуре столика от -150 С ультраструктурнаяотопография частиц биопрепаратов иклеток биоагента полностью сохраняется (таблица ).Плоскость скола проходит через.40частицы биопрепарата или их естественные поверхности. В частицах биопрепарата выявляют бактериальные клетки, равномерно распределенные в защитной среде. Скол проходит такжечерез естественные поверхности бактерии или через гидрофобные зоны высшей и цитоплаэматической мембран клеток. В результате прохождения скола через гидрофобную зону мембран на 5 Окриофрактограммах выявляют РР (выпуклая) и НР (вогнутая ) поверхностивнешней и цитоплазматических мембран. На РР-поверхности внешней и цитоплазмзтических мембран обнаруживаютглобулярные 1 полиферментные ) частицы. Изучение плотности, величины,лабильности таких частиц на поверхности мембран бактерии в обезвоженномсостоянии ( в анабиозе ) представляется важным при морфофункциональной оценке сухих водорастворимых .биопрепаратов и клеток, заключенныхв них,Исследование криофрактограмм таких объектов показывает также, чтоскол проходит и через цитоплазмуклетки. Цитоплазма клеток в обезвоженном состоянии имеет фибриллярногрануляторное строение. Фибриллярныеобразования цитоплазмы соответствуютструктурам нуклеотида.Таким образом, выдерживание сухихводорастворимых биопрепаратоа в 17. -ном растворе формвара на дихлорэтанепри их препарировании для криофрактографического анализа обеспечивает качественное и равномерное замораживание образца, что позволяет сохранить ультраструктурную топографию биопрепарата и клеток, эаключенных в нем. Электронно-микроскопический ана лиз реплик с поверхности сколов,сухих водорастворимых биопрепаратов, пропитаных в 17.-ном растворе формвара на дихлорэтане в течение 5 с, 1 и 10 мин и сколотых в вакуумно-замора-, живающей установке (210хогг) при температуре столика - 140 С показывает,что реплики приих препарировании значительно повреждаются ., Это объясняется тем, что при температурео-140 С и выше дихлорэтан испаряется (табл. 1 ). Изобретение обеспечивает сохран ность ультраструктурной топографии сухих водорастворимых биопрепаратов в процессе их препарирования для криофрактографического анализа, позволяет йзучить форму, размеры, ультраструктуру частиц биопрепаратов и характер распределения в них бактериальных клеток, позволяет исследовать естественную поверхность частиц биопрепарата, изучить ультраструктурную топографию естественных поверхностей клеточных структур и внутренних областей мембран бактерий в обезвоженном состоянии (в анабиозе ).1174380 Условия препарирования Исследуемыеобразцы Температура столика при ск алыв анин,.фС Время пропитываиия Среда пропитыванияэамороживания ) 1 Х-ный раствор формварана дихлорэтане Сухие водорастворимыебиопрепараты- 100 1Составитель В,ЧистяковТехред Ж.Кастелевич Корректор Л.Пилипенко Редактор Н,Яцола Заказ 5130/23 Ттраж 897ВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб д, 45 Подписное Филиап ППП "Патент", г,Ужгород, ул.Проектная, 4 Сухие водораст- Минеральноеворимые биопре- маслопараты- 170 -160 -150 -140 -170 Качество реплик:сохранена ультраструктурная топография частиц биопрепаратов и клеток (+1,не сохранена ( - )

Смотреть

Заявка

3481557, 11.08.1982

ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ПРИКЛАДНОЙ МИКРОБИОЛОГИИ

ГЕРАСИМОВ ВЛАДИМИР НИКОЛАЕВИЧ, КАМЫНИН АЛЕКСАНДР НИКОЛАЕВИЧ

МПК / Метки

МПК: G01N 1/38, A61B 10/00, G01N 1/42

Метки: электронно-микроскопическому, клеток, подготовки, препаратов, исследованию, бактериальных

Опубликовано: 23.08.1985

Код ссылки

<a href="http://patents.su/4-1174380-sposob-podgotovki-preparatov-bakterialnykh-kletok-k-ehlektronno-mikroskopicheskomu-issledovaniyu.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентов СССР">Способ подготовки препаратов бактериальных клеток к электронно-микроскопическому исследованию</a>

Похожие патенты