Способ определения трипсинингибирующей активности семян бобовых и злаковых культур

Номер патента: 967418

Авторы: Павлова, Бронштейн, Саянова

Скачать ZIP архив.

Текст

О П И С А Н И Е ( )967418ИЗОБРЕТЕН ИЯ Союз СоветскихСоциалистическихРестгублик К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(51) М. Кл.А 01 Н 1/04 А 01 6 7/00 Гееуллретвеекмй кемлтет Опубликовано 23.10.82. Бюллетень39(53) УДК 631.52: :581.6 (088,8) пе делам лзебретений и еткрытийДата опубликования описания 28.10.82(72) Авторы изобретения аянова, Л. С. Павлова и А. И. Брон теин Отдел генетики растений АН Молдавской С((54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТРИПСИНИНГИБИРУЮЩЕЛ АКТИВНОСТИ СЕМЯН БОБОВЫХ И З,ЛАКОВЫХ КУ,ЛЬТУР,1Изобретение относится к селекции растений и к прикладной ботанике и может быть использовано в сельском хозяйстве.Известно, что качество зерна определяется не только содержанием в нем белков, незаменимых аминокислот, углеводородов, 5 минеральных веществ, но в значительной мере наличием в.семенах антипитательных компонентов, влияющих на усвояемость растительных белков организмом животного и человека, К антипитательным веществам относятся, в частности, и ингибиторы протеаз, например, ингибиторы трипсина, которые инактивируются протеолитическую активность ферментов пищеварительного тракта, нару 1 пают усвояемость белков организмом, 15Ингибиторы трипсина составляют особую группу растительных белков, способных образовывать с трипсином устойчивые комплексы, угнетающие активность фермента. Они широко распространены в раститель ном мире и составляют значительную часть суммарного белка семян важнейших сельскохозяйственных культур.Наиболее эффективным путем уменьшения содержания ингибиторов трипсина в семянах является селекция сортов, свободных от ингибиторов или содержащих их в минимальных количествах.Известен способ определения трипсинингибирующей активности семян бобовых по скорости гидролиза белкового или синтетического субстратов 1.Однако способ очень трудоемок.Известен также способ определения трипсинингибирующей активности семян бобовых и,злаковых культур, включающий измельчение семян, экстрагирование раствором хлористого натрия, инкубирование экстракта на фотопленке, покрытой белковым веществом в присутствии трипсина и последующий учет результатов реакции. Белки ингибитора подвергают электрофорезу в агаровом геле, содержащих казеин. После чего казеин гидролизуют раствором трипсина. Казеиновый субстрат; защищенный от гидролиза присутствием ингибитора, проявляется при окрашивании белковым красителем в виде голубых пятен, по которым судят о присутствии ингибитора 2.Способ также трудоемок и низкопроизводителен, так как он предполагает обязательную процедуру очистки от балластныхной, проявленной и фиксированной фотопленки и инкубируют 8 - 12 мин при 25 С. После чего пленку промывают в дистиллированной воде и высушивают на воздухе.Отбор генотипов по указанному признаку производят путем сравнения степени прозрачности гидролизованных зон желатинового слоя фотопленки остаточным количеством трипсина (после ингибирования экстрактами семян) исследуемого материала и контрольных образцов. Трипсинингибирующую активность оценивают в баллах по степени 50 55:р ор;.х;.;ранний, для чегог,: ложные приемы ,х : . з зь,оаливание, диализ, лио; и дс .о,лите,занан процедура подстОатя (ягяоовьЙ гю о с каи проведение опыта в тсчение окоа еше способ требует наличия специального электрофоретического оборудования и значительного количества испытуемого материала - все это не позволяет обнаруживать ингибиторы трнпсина в части от10 дельных семян при сохранении их жизнеспособности.Целью изобретения является сохранение жизнеспособности исследуемых семян и упрощение самого процесса.Указанная цель достигается тем, что трипсин используют в концентрации 0,17 - 0,23% для,экстракта из семян бобовых и 0,02 - 0,03% для экстракта из семян злаков, причем инкубирование экстракта проводят на фотопленке, предварительно экспонированной, проявленной и фиксированной, для покрытия ее в качестве белкового вещества используют желатину, и процесс инкубирования ведут для экстракта из семян бобовых в течение 8 - 12 мин, а для экстракта из семян злаков в течение 18 - 22 мин, при этом учет реакции осуществляют по степени прочности образующихся на желатине гидролизованных зон на фотопленке в сравнении иссл:дуемых семян с семянами эталонного сорта.Пример 7. Отбор проводят на селекцион- ЗО но-генетическом материале сои (500 образцов) коллекции Отдела генетики расте,ний АН Молдавской СССР, включающийот, линии, отдельные растения. Средняяврооа материала выполнена по общепринятой .етодике.Навеску средней пробы семян сои, измельченной в электрической мельнице до размера частиц муки 0,1 мм, экстрагируют О,в 0,3 М раствором хлористого натрия в соотношении 1:75 (г/мл) в течение не менее 1 ч,К полученному экстракту ингибиторов приливают раствор трипсина 0,17 - 0,33% и трисбуфер рН 8,2 (содержащий 0,2 М МаС 1) в соотношении 1:1:1 (мл). Смесь выдерживают 3 - 5 мин, одинаковые капли инкубационной смеси (0,01 - 0,03 мл) контрольных и исследуемых образцов наносят на желатиновый слой предварительно экспонированпрозрачности пятна, исходя из экспериментальных данных о том, что низкоингибиторный образец образует прозрачное пятно,среднеингибиторный - серое, высокоингибиторный - черное пятно,В результате из 500 исследуемых образцов сои отобрано 53 с низким содержаниемингибиторов трипсина, перспективных длявключения в селекционный процесс на улучшение питательной ценности зерна сои,Пример 2. Оценку трипсинингибирующейактивности единичных семян проводят наконтрастных по содержанию ингибиторовтрипсина 13 сортах сои,В этих опытах 20 семян каждого сортаразделяют на кожуру, соевую часть зародыша и семядоли, последние рассекают на 6сегментов, в которых определяют трипсинингибирующую активность. В результате установлено незначительное содержание ингибиторов трипсина в кожуре (около 10% общей активности семени) и равномерное распределение их в семядоли. Соответственноотбор в этом случае производят путем отсечения участка семени для анализа как исследуемых, так и контрольных образцов изидентичных мест семядоли. Отрезаннуючасть семени (не менее 10 мг) взвешивают,растирают в ступице до размера частиц порядка 0,1 мм и экстрагируют. Анализ и отбор низкоингибиторных семян аналогиченпроцедуре, описанный в примере 1.Семена, подвергнутые такой процедуре,пригодны для высевания и проведения дальнейших селекционных работ.Пример 3. Отбор по признаку трипсинингибирующей активности зерновых культурпроведен на селекционно-генетическом материале пшеницы (100 образцов) коллекцииотдела генетики растений АН Молдавской ССР.Для образцов пшеницы экспериментально установлены оптимальные параметры фермент-ингибирующей системы: концентрациятрипсина - 0,02 - 0,03, соотношение мука:экстра гент - 1:4 (г/мл), соотношение буфер: фермент: ингибитор - 1,1:1 (мл), время инкубации фермента с субстратом18 - 22 мин при 25 С.Выявлены образцы пшеницы, отличающиеся низкой, средней и высокой активностью ингибиторов трипсина, и которые составляют 15,50 и 35% от общего количестваисследованного материала соответственно.Процедура анализа и отбор зерна пшеницы по признаку трипсинингибирующейактивности аналогичны процедуре, описанной в примере 1.Разработанный способ позволяет использовать малые количества испытуемого материала (вплоть до 1/10 - 1/20 части зерна)при хорошей воспроизводимости и необходимой точности, высокой производительности(100 - 200 анализов в день), простоте выполнения анализа и экономном расходова967418 формула изобретения Составитель М. Дранишников Техред И. Верес Корректор М. Демчик Тираж 699 Подписное ВНИИ ПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий13035, Москва, Ж - 35, Раушская наб., д. 4/5 филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4Редактор Н. Бобкова Заказ 7195/7 нии реактивов отечественного производства, пригоден для отбора, по результатам анализа части семени с дальнейшим использованием остатка семени в селекционном процессе, позволяя, таким образом, сохранить ценный исходный и селекционный материал, Способ может быть использован дЛя скрининга большого набора селекционно-генетического материала (сорта, линии, отдельные растения, единичные семена) по признаку трансингибирующей активности и для выявления доноров низкоингибиторности, необходимых для селекции в направлении улучшения питательной ценности, усвояемости белков зерна бобовых и злаковых культур. Способ определения трипсинингибирующей активности семян бобовых и злаковых культур, включающий измельчение семян, экстрагирование раствором хлористого натрия, инкубирование экстрактов на фотопленке, покрытой белковым веществом в присутствии трипсина и последующий учет результатов реакции, отличающийся тем, что,6с целью сохранения жизнеспособности семяни упрощения процесса, трипсин используютв концентрации 0,17 - 0,23% для экстрактаиз семян бобовых и 0,02 - 0,03% для экстракта из семян злаков, причем инкубирование экстракта проводят на фотопленке, предварительно экспонированной, проявленнойи фиксированной, для покрытия ее в качестве белкового вещества используют желатинуи процесс инкубирования ведут для экстракта из семян бобовых в течение 8 - 12 мин,а для экстракта из семян злаков в течение18 - 22 мин, при этом учет реакции осуществляют по степени прозрачности образующихся на желатине гидролизованных зон на фотопленке в сравнении исследуемых семян ссеменами эталонного сорта,Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Бенкен Н. И., Буданова В. И. Ингибиторы трипсина в семянах фасоли, Труды поприкладной ботанике, генетике, селекции.20 М 1976 56 3 67 732. ЬеЫ 1 Е) 5 е 1 а М 1 сгое 1 ечфгор 1 огебсгпе 1 Ьо 1 ог. йе де 1 есбоп о рго 1 е 1 пазе птЬ 1- 1 огз. - Апау 1. Вос 1 еп 1., 1978, 88, 2, 417 -424 (прототйп),

Смотреть

Заявка

2923931, 13.05.1980

ОТДЕЛ ГЕНЕТИКИ РАСТЕНИЙ АН МССР

САЯНОВА ВАЛЕНТИНА ВАСИЛЬЕВНА, ПАВЛОВА ЛЮДМИЛА СТЕПАНОВНА, БРОНШТЕЙН АЛИСА ИОСИФОВНА

МПК / Метки

МПК: A01H 1/04

Метки: злаковых, семян, трипсинингибирующей, бобовых, культур, активности

Опубликовано: 23.10.1982

Код ссылки

<a href="http://patents.su/3-967418-sposob-opredeleniya-tripsiningibiruyushhejj-aktivnosti-semyan-bobovykh-i-zlakovykh-kultur.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентов СССР">Способ определения трипсинингибирующей активности семян бобовых и злаковых культур</a>

Похожие патенты