Скачать ZIP архив.

Текст

ОПИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Союз Советских Социалистических Республик) Дополнительное к авт. сви 51)М. Кл.2С 07 С 7/02 А 61 К 37/4 0 22) Заявлено 070477 (21) 2471011/с присоедиНением заявки МВ -ПриоритетОпубликовано М 41,1 1.79. Бюллете Дата опубликования описания 72) Авторы йзобрете Варнавская, А.А.Селезнева, Г.В.Самсонов, И.М.Терешин н И,М.Рабинович 1) Заявитель Всесоюзн институт научно-исследовательский технологическийтибиотиков и ферментов медицинского назначения с. - АМИЛАЗЫ ПОСОБ ОЧИС и,сок Опт цес до из 1Изобретение относится к области физхимии, а именно к способу очистки фермента сс,-амилазы (КФ 3.2.1.1). Высокоочищенные Ферментные препараты могут найти применение в пищевой и фармацевтической промышленности в лабораторной практике.В литературе описан способ очисткиоС-амилазы из нативного раствора Аэрегд 111 цв егг 1 со 1 а при использовании макросетчатого карбоксильного катионита КМТ :1), По этому способу нативный раствор Аврегд 111 цэ т;еггсо-.1 а, содержащий амилазную и протеазную активности сорбируют на катионите КМТ в условиях полного насыщения сорбента амилазной активностью. Далее производят десорбцию ферментов с катионита. Однако по этому способу получают ферменты с небольшим выходом продукта от нативного раствора: амилазы 15-20, протеазы 25-30, Активные Фракции ферментов содержат не более 70 амилазы и 90 впроАЕ ПЕ теазы.С целью получения высококонцентрированных элюатов, увеличения выхода фермента и сокращения длительности процесса предлагается сорбцию .о - -амилазы на карбоксильном макросетчатом катионите, представляющем сополимер метакриловой кислоты и диметакриламида (КМДИ), проводить в условиях неполного (на 40-60) насыщениясорбента сорбатом.Длительность процесса сорбцииращаетсяпри этом в 1,5-2,0 раза.имальным является проведение проса сорбции амилазы ионитом КМДМконцентрации фермента на выходеколонки, составляющей 40-60от концентрации амилазы в исходномрастворе. Выход Фермента в процессе элюации при этом составляет 90100, а концентрирование амилазыувеличивается в 2,5-3,0 раза посравнению с полным насыщением катионита ферментом (см .таблицу),Процесс очистки с(;амилазы из на 20тивного раствора Азрегд 111 цз егг 1- со 1 а проводят следующим образом.1, Производят дипегментацию нативного раствора на анионите ФАФ (К набфа 1,9-2,4), не сорбирующего Ферменти задерживающего окрашенные примеси.Характеристикой процесса являетсяэкстинкция при 350 нм (длина волны,характеризующая пигменты Азр. сег=,г 1 со 1 а), обесцвеченный раствор недолжен иметь Ед больше 0,1.2. Производят сорбцию амилазы и протеазы иэ осветленного нативного раствора макросетчатым карбоксильным ,катионитом КМДМ при равновесном значении рН 4,0,3. Производят десорбцию Ферментов со смолы методом ступенчатой элюции. 1 ступень. Десорбция амилазы 0,1 М ацетатнымбуферным раствором РН 5,0. Контроль за ходом процесса осуществляют измерением оптической плотности элюатов при длине волны 280 нм и определением амилолити- ческой активности. П ступень. Десорбция протеазы 0,1 М фосфатным буферным раствором рН 7 О. Контроль - из)5 мерение поглощения при.280 нм, определение протеолитической активности.4. Высокоактивные элюаты амилазы и и протеазы подвергают лиофильной сушке.Описываемый способ дает воэможность получйть своббдный от примесей других белков (при диск-электрофорезе и полиакриламидном геле при РН 7,5 и РН 8,9 получена одна полоса) амилолитический ферментный препарат . Кроме того, описываемый способ сокращает длительность стадии сорбции, элюция амилазы осуществляется в более мягких условиях, что важно при раббге с лабильными Физиологически активными 30 веществами.П р и м е р 1. Нативный раствор с аийлолитической активностью 36 - иАЕ протеолитической активностью 10 в количестве 5000 мл пропускают через колонку с анионитом ФАФ в С 1- форме с коэффициентом набухания 2,0. Объем смолы 200 мл, Депигментация нативного раствора прОисходит без потери амилолитической и протеоли тической активностей.Обесцвеченный нативный раствор подкисляют до РН 4,0. Выход. на этой стадии составляет 75 по амилолитической и 70 по протеолитической 45 активностям от исходного нативного раствора. Весь подкисленный раствор (Ч = 5000 мл)с активностями 27 де и 7,0 в , пропускают через колонкуПЕс 5 г КМДИ в смешанной натрий-водо- . родной форме ( смола уравновешена 0,5 М ацетатным буферным раствором РН 4,0) . В этих условиях имеет место 50-ное насыщение смолы амилазой (активность на выходе из колонки в конце сорбции составляет 13,5). Процент сорбированных ферментов от всего пропущенного через катионит количества равен для амилазы 90, для протеазы 85, а выход ферментов на стадии сорбции от исходного натив ного раствора составляет 67,5 и 60 соответственно. После сорбции смолу в колонке промывают 20 мл 0,1 М ацетатным буферным раствором рН 4, О. Первую десорбцию осуществ ляют 0,1 М ацетатным буферным раствором РН 5 О. Сначала выходит наиболее активная фракция амилазы -105 мл с активностью 900, РН4,7, не содержащая протеазы. ЭтаФракция содержит 77 от сорбированной амилазы (или 70 от пропу-щенного количества) . Затем следующие300 мл злюата имеют активность от 25до 10 . Десорбция амилазы осуществляется с полным 100-ным выходом отсорбированной амилазы. Однако для получения препаратов ферментов используют только высокоактивные элюаты. Вданном случае фракция с активностью900 всоставляет 84 от всей десорбиАЕрованной амилаэы и 52 от количествафермента в исходном нативном растворе (36х 5000 мл) .Вторую десорбцию - элюцию протеолитического Фермента осуществляют 0,1 МФосфатным буферным раствором РН 7,0.Протеаза выходит, начиная с РН 6,2.Высокоактивная фракция - 250 мл сактивностью 98 в , содержит 82 от сорбированной протеазы (или 70 от пропущенного количества) . Всего десорбируют 91 сорбированного фермента.Выход на стадии десорбции протеаэыв активной фракции составляет 49от количества в исходном нативномрастворе (10 , х 5000 мл) .ПЕПри лиофилйзации элюатов ферментов потери не превышают 5,0,Таким образом, общий выход отнативного раствора составляет: амилазыпорядка 50, протеазы - 46.П р и м е р 2. Нативный растворв количестве 5000 мл с активностью35 ви 10 пропускают через колонАЕ ПЕку с 200 мл анионита ФАФ в С 1-Формес коэффициентом набухания 2,0. Потери ферментативной активности ненаблюдается. Обесцвеченный нативныйраствор подкисляют до РН 4,0, А 1 милолитическая активность подкисленногонативного раствора равна 25АЕпротеолитическая - 7,0 - . ВйходПЕ мна стадии подкисления для амилазысоставляет 71, для протеазы 70.Сорбцию ферментов осуществляютна КМДМ, уравновешенном 0,5 М ацетатным буферным раствоРом РН 4,0,количество сорбента 5 г. КМДИ насыщается амилаэой на 45 (активностьнативного раствора на выходе из колонки в конце сорбции 11,3 в ,) . Процент.АЕсорбированных ферментов от пропущенного количества составляет для амилазы 85, для протеазы 85, а выход отисходного нативного раствора - 61и 59,5 соответственно. После сорбции смолу в колонке промывают 20 мл0,1 И ацетатным буферным растворомРН 4,0.Десорбцию амилазы осуществляютлри РН 5,0 0,1 М ацетатньм буфернымраствором. Первые 105 мл элюата имеют(концентрирование) 33 14 30 12100- 90 95 90 10 25 13 20 16 30 Выход, 90 90 90 95 87 95 С - отношение концентрации фермента на выходе иэ колонки к исходной концентрации в растворе, . Формула изобретения Составитель А .БочаровТехред С. Мигай Корректор И.Михеева Редактор С.Лазарева е Заказ 6700/25 Тираж 513 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Филиал ППП Патент, г .Ужгород, ул. Проектная, 4 активность 750 Я- и содержат 74 сорбированной амйлазы (или 63 от пропущенного количества), следующие 70 мл элюата имеют активность 190 Я" Всего десорбируют 95 амилазы. Десорб,цию протеазы проводят при рН 7,0 0,1 М 5 (фосфатным буферным раствором. Актив" ные фракции начинают выходить при рн 6,1, высокоактивная фракция.про= теаэы (250 мл) имеет активность 84ПЕ и содержит 70 от сорбированного фермента (или 60 отпропущенного количества) . Всего десорбируют 90 1 Способ очистки с-амилазы (КФ.40 .3.2.1.1) из нативного раствора Аэрегд 111 цз Сегг 1 со 1 а посредством хроматографии на макросетчатомкарбоксильном катионите - сополимере метакриловой кислоты и диметакриламида, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью получения высококонцентпротеазы. Так как для получения препаратов ферментов используют высокоактивные элюаты ферментов, то выход на стадии десорбции от исходного нативного раствора составляет для амилазы порядка 51, для протеазы 42.При лиофильной сушке потери фер.ментативной активности минимальны и ъе превышают 3. Общий выход ферментов от нативного раствора составляет для амилазы порядка 50, для протеазы 40. рированных элюатов, увеличения выхода фермента, а также сокращения длительностипроцесса, сорбцию амилазы проводят в. условиях неполного на 40-60 насыщения сорбента сорбатом.Источники информации, принятые во внимание при экспертизе1. Авторское свидетельство СССР 946.5912, кл., С 07 0 7/028, 1974.

Смотреть

Заявка

2471011, 07.04.1977

ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ АНТИБИОТИКОВ И ФЕРМЕНТОВ МЕДИЦИНСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ

ВАРНАВСКАЯ ОЛЬГА ВАСИЛЬЕВНА, СЕЛЕЗНЕВА АИДА АЛЕКСАНДРОВНА, САМСОНОВ ГЕОРГИЙ ВАСИЛЬЕВИЧ, ТЕРЕШИН ИГОРЬ МИХАЙЛОВИЧ, РАБИНОВИЧ ИЛЬЯ МОИСЕЕВИЧ

МПК / Метки

МПК: A61K 38/46

Метки: амилазы

Опубликовано: 05.11.1979

Код ссылки

<a href="http://patents.su/3-696024-sposob-ochistki-amilazy.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентов СССР">Способ очистки -амилазы</a>

Похожие патенты