Способ консервирования гепатоцитов

Номер патента: 1813451

Авторы: Росляков, Мазур, Петренко, Грищук

Скачать ZIP файл.

Текст

Смотреть

СОК)3 СОВЕ ГСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕ СКИХРЕСПУВПИК 9) я)5 А 61 К 47/00 ГОСУДАРСТВЕННОВЕДОМСТВО СССР(21) 4870736/ (22) 02.10,90 (46) 07.05,93. (71) Институт омедицины А (72) А.Ю.Петр ков и С.П,Маз (56) Авторское М 902695, кл. (54) СПОСОБ ТОЦИТОВ А об илл имер Примертов вскрывали брованных живвводили канюлюли нижнюю пол Бюл. %17проблем криобиологии иН УССРенко, В.П.Грищук, А.Д.РоУРсвидетельство СССРА 01 й 1/02, 1979.КОНСЕРВИРОВАНИЯ ГЕ Изобретение относится к биологии и медицине и может быть использовано для консервирования клеток, выделенных из тканей.Цель изобретения - повышение морфофункциональной сохранности гепатоцитов,Поставленная цель достигается тем, что в способе консервирования гепатоцитов, включающем инкубацию суспензии клеток в среде, содержащей диметилсульфоксид, с последующим ступенчатым охлаждением до температуры жидкого азота, в среду суспендирования добавляют СаОг, охлаждение проводят в два этапа; на первом этапе суспензию клеток охлаждают до (-20)+28)С и выдерживают 20-60 мин, а затем помещают в жидкий азот,юстрируется. следующими , Для выделения гепатоцирюшную полость анестезитных массой 200-300 г, в воротную вену, надсекаую вену и перфузировали(57) Использование; биология, медицина, криобиология, Цель изобретения - повышение марфо-функциональной сохранности гепатоцитов. Сущность изобретения - гепатоциты инкубируют при 244 С с 10-15- ным диметилсульфоксидом в течение 10-15 мин. замораживают до (-20)-(28)С, выдерживают при этой температуре 20-60 мин, затем погружают в жидкий азот и замораживают до -196 С, 3 табл. печень со скоростью 25-35 мл/мин при 37 С раствором, содержащим 0,25 М сахароэу, 5 мМ КО, 0,4 мМ КНгР 04, 1,6 мМ йаНР 04, 0,8 мМ М 9 Ог, 50 мМ трис-НО, 4 мМ ЭДТА, рН 7,4. После окончания перфузии печень извлекали иэ брюшной полости, измельчали и подвергали дезагрегации с помощью вибрационного устройства в среде перфузии, где а ЗДТА заменяли на 2 мМ СаОг. Полученную р суспенэию Фильтровали через нейлоновый фильтр, Жизнеспособные клетки отделяли путем дифференциального центрифугирования и суспендировали в среде дезагрегации. Гепатоциты, суспендировали в среде,О содержащей 250 мМ сахароэы, 5 мМ КО, 0,4 ф мМ КНгРО 4, 1,6 мМ ИаНР 04, 0,8 мМ М 9 Ог,50 мМ трис-НО, 2 мМ СаОг (рН 7,4), инкубировали при 2 - 4 С с 100 ь-ным ДМСО, при- д готовленным на этой же среде, в течение 10 мин. Консервирование гепатоцитов осуществляли по следующей программе: на первом этапе охлаждали от 2 до -25 С путем погружения контейнеров с суспензией клеток в жидкость, предварительно охлажденную до -25 С, и выдерживали при этой температуре,25+ 1,80+ 30 мин, На втором этапе охлаждали до С, погружая контейнеры в жидкий азот,Морфологический анализ суспензии гепатоцитов проводили методом окрашивания 0,2%-ным раствором трипанового синего. Дыхательную активность определяли полярографически. Детоксикационную активность определяли по образованию рнитрофенола при инкубации гепатоцитов при 35 С с р-нитроанизолом,В табл. 1 представлены морфофункциональные характеристики гепатоцитов, консервированных предлагаемым способом и способом прототипом,Результаты, приведенные в табл, 1, показывают, что использование данного способа позволяет получить консервированные гепатоциты, дыхательная активность которых в 2 раза меньше по сравнению с прототипом, Эффективность окислительного фосфорилирования митохондрий в составе клетки также лучше сохраняется при использовании этого способа. Особенно резкие различия между способами были выявлены при определении коэффициента стимуляции дыхания сукцинатом, который характеризует целостность плазматической мембраны клеток (сукцинат слабо проникает через интактную плазматическую мембрану), Клетки, консервированные предлагаемым способом, способны осуществлять детоксикацию ксенобиотиков, что позволяет использовать их для лечения пеценочной недостаточности.П р и м е р 2. Способ осуществляли аналогично примеру 1, только изменяли конечную температуру охлаждения на первом этапе,Из табл, 2 видно, что оптимальной температурой остановки на первом этапе охлаждения является (-20 Н) С, При снижении температуры сохранность изолированных геИсключение трипанового синего, % Скорость эндогенного дыхания, нмоль 02 мин/мг белка Коэффициент стимуляции эндогенного дыхания сукцинатом Коэффициент стимуляции эндогенного дыхания разобщителемпатоцитов снижается почти на 30%, а приповышении - на 38%.П р и м е р 3, Способ осуществлялианалогично примеру 1, только изменяли5 время температурной остановки.Из табл. 3 видно, что оптимальным временем остановки на первом этапе охлаждения является 20-60 мин, При уменьшении иувеличении времени остановки сохранность10 изолированных гепатоцитов снижаетсяна25-30%,Преимущества способа,1. Способ обеспечивает высокую морфо-функциональную сохранность гепатоци"5 тов: скорость эндогенного дыхания в 2 разавыше, чем по прототипу, в степень с"гимуляции дыхания сукцинатом, как показательинтактности плазматической мембраны, в 3раза ниже, Сохранение детоксикационной20 функции консервированных гепатоцитовпозволяет использовать их как для изучениямеханизмов биотрансформации ксенобиотиков, так и для лечения печеночной недостаточности.2, Способ проще прототипа, посколькупредусматривает двухэтапное охлаждениеобразца. Формула изобретения30 Способ консервирования гепатоцитов,включающий инкубацию суспензии клеток всреде, содержащей диметилсульфоксид, споследующим ступенчатым охлаждениемдо температуры жидкого азота, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью повышенияморфо-функциональной сохранности гепатоцитов, в среду суспендирования добавля- ют хлористый кальций, охлаждение проводятв два этапа, при этом на первом этапе сусф пензию клеток охлаждают до ("20)+28) С ивыдерживают в течение 20-60 мин, а затемпомещают в,жидкий азот,-196 С 47+ 4 85 . 5 85 + 8 77 + 8 60 - 7 53+ 7 Таблица 3 Время остановки, мин Показатель 60 0 80 10 20 30 18 - 4 657 85- 8 86 6 82+961-7 84+ 5 Редактор Заказ 1796 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент". г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 Исключение трипанового синего. Исключение трипанового синего,

Заявка

4870736, 02.10.1990

ИНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРИОБИОЛОГИИ И КРИОМЕДИЦИНЫ АН УССР

ПЕТРЕНКО АЛЕКСАНДР ЮРЬЕВИЧ, ГРИЩУК ВИКТОР ПЕТРОВИЧ, РОСЛЯКОВ АНДРЕЙ ДМИТРИЕВИЧ, МАЗУР СВЕТЛАНА ПЕТРОВНА

МПК / Метки

МПК: A61K 47/00

Метки: гепатоцитов, консервирования

Опубликовано: 07.05.1993

Код ссылки

<a href="http://patents.su/3-1813451-sposob-konservirovaniya-gepatocitov.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентов СССР">Способ консервирования гепатоцитов</a>

Похожие патенты