Способ определения модифицированного альбумина в крови человека

Скачать ZIP файл.

Текст

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 1772744 19) 1 й 33/48 51) АНИЕ ИЗОБРЕТЕН СВИДЕТЕЛЬСТВУ К АВТОРС ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР(56) Ажицкий Г,Ю. и др, Транзиторные минорные фракции сывороточного альбуминачеловека: физико-химические свойства. //Вопросы медицинской химии. - 1984, т. 30,вып, 5, с. 50-56.(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МОДИФИЦИРОВАННОГО АЛЬБУМИНА В КРОВИЧЕЛОВЕКА Изобретение относится к медицине и может быть использовано при определении модифицированного альбумина в крови человека,Известен способ определения модифицированного альбумина, включающий изоэлектрическое фокусирование (ИЭФ) в геле с использованием борат-полиольного градиента рН в одно- и двухмерной системе. Альбумин выделяют препаративным электрофорезом (ЭФ) в агарозном и полиакриламидном гелях (ПААГ). Аналитическое и препаративное ИЭФ в борат-полиольной системе осуществляют в ПААГ, В качестве буферного раствора используют 0,1 М барную кислоту, оттитрованную трисом до рН 7,5. После ИЭФ гель извлекают из трубочки и окрашивают кумасси 6-250, При препаративном ИЭФ из гелевого блока вырезают контрольную полоску, окрашивают ее; из блока вырезают участки геля, соответствую;(57) Использование: в области медицины, в частности в клинической биохимии. Сущность изобретения: из сыворотки крови больного осаждают глобулины сульфатом аммония, надосадочную жидкость разбавляют раствором хлорида натрия до конечной его концентрации 0,8-1,0 М и белка 0,2-0,5 мг/мл, измеряют флуоресценцию при длине волны возбуждения 296,8 нм, определяют интенсивность флуоресценции при длинах волн 320 и 365 нм и рассчитываютих соотношение. Способ прост в исполнении и позволяет повысить чувствительность определения модифицированного альбумина табл. щие белковым фракциям. Гель измельчают на холоду и элюируют на воронке с бумажным фильтром. Элюат троекратно промывают в стакане для ультрафильтрации (фильтр УАМ"Владипор") дистиллированной водой, а затем 0,1 М фосфатным буфером рН 7,0, после чего фракции концентрируют. До- Ы полнительная очистка от примеси глобулинов осуществляется методом препаративного диск-электрофореза в ПААГ. Для определе- ф ния дисперсии оптического вращения и спектров кругового дихроизма используют концентрации белка в пробах 1 мг/мл. Дан- фф ный способ принят за прототип;К недостаткам способа относятся: сложность осуществления, длительность и необходимость накопления для анализа сравнительно высоких концентраций белка, что ограничивает возможность использования этого метода и значительно снижает его чувствительность.ЗО хлорида натрия параметры спектров флуоресценции не зависят. от ионной силы раствора. При концентрации белка нижец,2 45 50 Целью изобретения является упроще. ние, ускорение, а также повышение чувстви 1 с,пьности сГ особа.Поставленная цель достигается тем, что в способе определения модифицированного альбумина в крови человека,. включающем биохимическое исследование крови, согласно изобретению, из сыворотки крови осаждают глобупины сульфатом аммония, надосадочную жидкость разбавляют раствором хлорида натрия до конечной концентрации белка 0,2-0,.5 мг/мл и конечной концентрации хлорида натриями,8-1;О М, измеряют флуоресценцию при длине волны возбуждения 296,8 нм; определяют интенсивности флуоресценции при длинах волн 320 и 365 нм и рассчитывают их соотношение,Выделение альбуминов из сыворотки крови путем осаждения глобулинов сульфатом аммония не требует больших затрат времени и сложного оборудования. Применение СФЛ анализа позволяет работать с низкими концентрациями белка; для проведения исследования необходимо 0,2-0,5 мг/мл (или О,ООЗ мл исходной сыворотки крови), что существенно повышает чувствительность способа. В прототипе для анализа требуется 1 мл/мл, В способе на анализ крови одного больного затрачивается 25 ч,а в прототипе - сутки и более. Раствор хлорида натрия не влияет на спектральные характеристики альбумина, Гри концентрации хлорида натрия ниже 0,8 М белок после семидневного хранения выпадает в осадок, кроме того в такой среде быстро размножаются микроорганизмы; при концентрации хлорида натрия выше 1 М, ионная сила раствора столь высока, что может привести к изменению характеристик триптофановой флуоресценции. В пределах указанных величин концентраций мгlмл вклад во флуоресценцию примесей, содержащихся в растворителе, становится сопоставимым с уровнем свечения самого белка. При концентрации белка выше 0,5 мг/мл существенным становится отклонение от линейной зависимости между концентрацией белка и интенсивностью флуоресценции.Способ может быть осуществлен следующим образом, Из сыворотки крови человека осаждают глобулины. методом высаливания в присутствии 33 сульфата амония при постоянном перемешивании в течение двух часов п ри комнатной температуре. Суспензию центрифугируют при 700 о в течение 10 мин при комнатной температуре, Надосадочную жидкость используют дляпроведения спектрофлуориметрических исследований после соответствующего разбавления хлоридом натрия до конечнойконцентрации белка 0,2-0,5 мг/мл и конечной концентрации хлорида натрия 0,8-1,ОМ,СФЛ анализ одной пробы длится в среднем1 мин. Полноту осаждения глобулинов контролируют методом диск-электрофореза вПААГ. В качестве характеристики спектрафлуоресценции используют величину параметра А, представляющую отношение интенсивностей на склонах спектрафлуоресценции и являющуюся очень чувствительной характеристикой даже небольших спектральных сдвигов: А = з 20/з 65,гдеи, - интенсивности в спектрахфлуоресценцйи при длинах волн 320 и 3650 нм соответственно.. Характер спектров флуоресценции испектров поглощения (максимум в области280 нм) препаратов альбуминов из сыворотки доноров и больных хроническим гломеру 5 лонефритом (ХГН) свидетельствует о том,что во всех случаях флуоресценция обусловлена собственными хромофорами белка -триптофановыми и тирозиновыми остатками. При возбуждении излучением с длинойволнь 1 296,8 нм, т,е. в той спектральной области, где вклад тирозиновых остатков в поглощении незначителен, регистрируетсятолько флуоресценгция триптофана, привозбуждении излучением с длиной волны 285 нм, наряду с триптофановыми остатками,значительный вклад в коротковолновой области спектра дают тирозиновые остатки, Вслучае сывороточного альбумина доля тирозиновых остатков в излучении значительна,0 поскольку в составе молекулы этого белкаимеется 18 тирозииовых и только 1 триптофановый остаток. В настоящей работе решено ограничиться анализом толькотриптофановой флуоресценции. Поэтомупараметр А измерялся при возбуждениидлиной волны 296,8 нм.При м ер 1. Больной Ленцер Д.А. 24гдиагноз мембранозно-пропиферативныйгломерулонефрит с нефротическим синдромом, суточная потеря белка (СПБ) 6,5 г/сут.концентрация альбумина в крови - 20,0 г/л.Выделение альбуминов из сыворотки кровипроводили по приведенной выше методике,определяли параметр,А при концентрации5 альбумина 0,20 мг/мл, концентрации хпорида натрия 0,8 М. Получили величину параметра А = 1,62.ф 0,02,П р и м е р 2, Больной Ленцер ДА.Определяли параметр А при концентрацииальбумина 0,5 мт/мп, концентрации хпори1772744 Составитель Т.ПархоменТехред М,Моргентал рректор Н,Ревск актор Тираж ПодписноеГосударственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва. Ж, Раушская наб 4/5 аэ 38ВНИИ. Ужгород, ул.Гагарина, 1 оизводственно-иэдательский комбинат " да натрия 1,0 М. Получили величину препарата А = 1,63+0,04,П р и м е р 3. Больной Ленцер Д.А, Определяли параметр А при концентрации альбумина 0.3 мг/мл,. концентрации хлорида натрия 0,9 М. Получили величину параметра А: 1,65+0,02.П р и м е р 4. Донор В., 18 лет, практически здоров. Определяли параметр А при концентрации альбумина 0,3 мг/мл и концентрации хлорида натрия 0.9 М. Получили величину параметра А = 1,22+0,02.Результаты исследования представлены в таблице,Средняя величина параметра А для 12 здоровых доноров составляет 1,26+0,01. Из данных таблицы следует;Больные ХГН и здоровые доноры различаются по параметру А (спектр распределения) с Р0,001 по критерию Вил коксона-Манна-Уитни,Обнаружена высокодостоверная, приближающаяся по величине к прямой функциональной связи зависимость между величиной параметра А и суточной протеинурией. Коэффициент ранговой корреляции по Спирмену р.885; Р0,005. Имеется достоверная обратная зависимость между уровнем альбумина в сыворотке крови и величиной параметра А, р"-0,461, Р0,05.5 Применение способа позволяет упростить, ускорить методику и повысить чувствительность определениямодифицированного альбумина. Используемые реактивы и методы исследования по 10 зволяют сохранить первоначальнуюструктуру модифицированного альбумина,находящегося в сыворотке крови,Формула изобретенияСпособ определения модифицирован 15. ного альбумина в крови человека путем еебиохимического исследования, о т л и ч а ющ и й. с я тем,.что, с целью упрощения,ускорения и повыаения чувствительностиспособа, из сывороткикрови осаждают гло 20 булины сульфатом эммония, надосадочнуюжидкость разбавляют раствором хлорида.натрия до конечной его концентрации 0,81,0 М, измеряют флуоресценцию при длиневолны возбуждения 296,8 нм; определяют25 ее интенсивность при длинах волн 320 и 365нм и рассчитйвают, соотноаение этих показателей.

Смотреть

Заявка

4840699, 18.06.1990

1-Й ЛЕНИНГРАДСКИЙ МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ ИМ. АКАД. И. П. ПАВЛОВА

ПАРХОМЕНКО ТАТЬЯНА ВАСИЛЬЕВНА, ТУРОВЕРОВ КОНСТАНТИН КОНСТАНТИНОВИЧ, КУЗНЕЦОВА ИРИНА МИХАЙЛОВНА, ЧУПРИНА ЯНИНА ВАЛЕРЬЕВНА, КОЖЕВНИКОВ АЛЕКСЕЙ ДМИТРИЕВИЧ, КУЛИКОВА АЛЕКСАНДР ИВАНОВИЧ

МПК / Метки

МПК: G01N 33/48

Метки: модифицированного, альбумина, крови, человека

Опубликовано: 30.10.1992

Код ссылки

<a href="http://patents.su/3-1772744-sposob-opredeleniya-modificirovannogo-albumina-v-krovi-cheloveka.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентов СССР">Способ определения модифицированного альбумина в крови человека</a>

Похожие патенты