Плазмидная днк pmtf59, предназначенная для транспозонного мутагенеза бактерий семейства еnтеrовастеriасеае

Номер патента: 1599434

Авторы: Фомичев, Титок, Прокулевич, Максимова

Скачать ZIP архив.

Текст

СОЮЗ ССВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИН 119) Ш),цц 5 С 12 И 15/ОО ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫ ИЯМПРИ ГКНТ СССР К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(71) Белорусский государственный университет .им. В,И. Ленина(54) ПЛАЗМИДНАЯ ЛНК рМТР 59 ПЛЯ ТРАНСПОЯОННОГО МУТАГЕНЕЗА БАКТЕРИЙ СЕМЕЙСТВА ЕИТЕНОВАСТРН 1 АСЕАЕ(57) Изобретение относится к биотех-нологии, а именно к енетической инженерии. Пель изобретения - конструИзобретение относится к областибиотехнологии, а именно генетической инженерии.Пелью изобретения является конструирование плазмиды рМТР 59, содержащей транспоэоны Тп 5, Тп 9 и проявляющей температурную нестабильность в клетках ЕпгегоЬасгег 1 асеаепри 37 С, которую можно использоватьдля транспозонного мутагенеза представителей этого семейства,Плазмида рМТР 59 является генетически модифицированным вариантомппазчиды рМ 38, обнаруженной ранеев клетках штамма Рзецдошопаз Яр,М,и получена путем встраивания в состав плазмиды рМ 38 транспоэоновТп 5 и Тп 9. 2ирование рМТР 59 мол.м. 40,8 Мя, содер-.1 жащей транспозоны Тп 5 и Тп 9 и проявляющей температурную нестабильность в клетках РпгегоЪасгегоасеае при 37 фС, которая предлагается для транспортного мутагенеза представителей этого семейства. Плазмида рМТР 59 состоит из плазмидь рМ 38, в которую встроены транспозоны Тп 5 и Тп 9. Плазмида детерминирует устойчивость к стрептомицину, канамицину и хлорамйениколу, Яша 1 - Есо 1471 - рагмент плазмиды рМТР 59 ответственен эа репликацию и температурнуюнестабильность плазмиди н бактериях семейства ЕпйегоЪасгегасеае. Плазмида рМТР 59 коньюгативна и может передаваться широкому кругу хозяев бактерий. Плазмида рМТР 59 включает детерминанту устойчивости к стрептомицину (Яш), транспозоны Тп 5 (Кш) и Тп 9 (Сш), а также область, ответственную эа репликацию и температурную нестабильность при 37 С, которая локализована,в,участке ЦНК протяженностью 6,9 т,п,о. и состоит из следующих элементовф Яша 1- ЦЬа 44- фрагмент (0,9 т.п.о,); ПЬа 44 Н 1 пй 111 - фрагмент (1,8 т,п,о,); Нп 1 П 1 " Вя 1 11 - фрагмент (0,2 т,п,о,): Вр 1 11 . - Ндп 111 - Фрагмент (1.,0 т.,п,о,)р Н 1 пй 111 - Яша 1 (0,1 т,.п.о.).; .Ята 1 - Есо 147 - фраг- мент (1,2 т,п,о.);. Есо 147 - Вр 1 11 Фрагмент (0,1 т.п.о.); Вя 1 11 Есо 1471 (1,6 т.п.о.) - 1 рагмент, 1599434Мол. м, плазмиды 40,8 Мя - размер61,2 т.п.о.Плазмида рЫТР 59 сообщает клеткам,н которых она находится, устойчивостьк трем антибиотикам " стрептомицину,канамицину и хлорамфениколу.Плазмида рМТР 59 конъюгативна ипередается широкому кругу хозяевсемейства РпгегоЬасйегасеае с частотой 10 -4- 10-, а н гомологичныешФаммы с частотой 10 /на клеткудбнора.Плазмида рМТР 59 находится в бактериях штамма Р,со 11 С 600/рМТР 59 15который хранится во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмовинститута ВНИИгенетика под У ВКПМВ 4309.Плазмида рМТР 59 обладает уникальной способностью наследонаться в неселективных условиях н клетках любого штамма сеяейства РпегоЬасгегасеае при 28 С и утрачиваться со1007,-ной частотой .при 37 С. 25П р и м е р 1, Клетки штаммаЕ,со 1 С 600, содержащие плазмидурМТР 59, выращивают в течение 18 чв жидкой питательной среде при 28 С,осаждают центрийугиронанием в течение 15 мин при 15000 я и ресуспендируют в прежнем объеме Физиологического. раствора. Затем из соответствующих разведений делают высевы на плотную питательную среду, содержащую канамицин н концентрации 25 мкг/мл дляотбора вариантов с транспозициейТП 5. Чашки с питательной средой перед засевом предварительно прогреваютпри 37 С в течение 20-30 мин. После 40посева бактерии культивируют при 37 Св течение 24-48 ч и затем выросшиеклоны проверяют на устойчивость костальным плазмидным маркерам, Клоны,наследующие только один маркер, соо"гветстнующий транспозону Тп 5,(Кшф)появляются с частотой 8,8 10(поотношению к исходному количеству клеток перед посевом), а среди них счастотой 1,17, отбирают ауксотройные50мутанты,П р и м е р 2. Для полученияауксотроАных мутантов используютштамм Егюп 1 а ЬегЬ 1 со 1 а 103 К/рМТР 59.Способ получения ауксотроных мутантов такой же, как и в примере 1, различия состоят в том, что частотаВтранспозиции транспозона Тп 5 вхромосому этого штамма 9,9 10 а ауксотрофные мутанты отбирают счастотой 5,57,П р и м е р 3. Для полученияауксотройных мутантов используютштамм Аитопатогенных бактерий Егт- па сЬгуяапгЬе 1 п 1 ЕИА 49/рМТР 59, Способ получения ауксотройных мутантовтакой же, как и в примере 1, разли"чия состоят в том, что частота транспозиции транспозона Тп 5 в хромосому этого штамма 1,2 10 -, а ауксотроАные мутанты отбирают с частотой2,07,П р и м е р 4. Для полученияауксотроАных мутантов используютштамм Фитопатогенных бактерий Егю 1 п 1 а яресея 106-7/рг 1 ТР 59. Способполучения ауксотроАных мутантов такой же, как и н примере 1, различиясостоят в том, что частота транспозиции транспозона Тп 5 н хромосомуэтого штамма 5, 10 , а ауксотроФные мутанты отбирают с частотой 1,57П р и м е р 5. Для полученияауксотроозных мутантов используютштамм ГггоЬасгег Ггецпд 1 1 467/рМТР 59,Способ получения ауксотроФных мутантов такой же, как и н примере 1, различия состоят в том, что частотатранспозиции транспозона Тп 5 нхромосому этого штамма 1,2 10а ауксотрофные мутанты отбирают счастотой 0,5 Х.П р и м е р 6. Для получения ауксотройных мутантоя используют штаммК 1 еЬяэ 11 а рпецшоп 1 ае 62-1/рМТР 59.Способ попучения ауксотройных мутантов такой же, как и н примере 1,различия состоят в том, что частотатранспозиции транспозона Тп 5 н хромосому этого штамма 6,7.10 з, а аук-,сотройные мутанты отбирают с частотой 0,36 Х.П р и м е р 7, Лля получения ауксотроАных мутантон используют штаммЯа 1 пюпе 11 а гурЬ 1 пцгдц 1 п 487/рМТР 59,Способ получения ауксотройных мутантон такой же, как и н примере 1, различия состоят в том, что частотатранспозицни транспозона Тп 5 в хромосому этого штамма 3,1 10 ", а ауксотроАные мутанты отбирают с частотой 2,07,П р и м е р 8. Для получения ауксотроАных мутантов используют штаммЯеггага шагсеясепя В/рМТР 59,Способ .получения ауксотройных мутантов такой же, как и н примере 1, раз1599434 6гается для получения транспозонныхо- мутантов у представителей различных:.родов и видов семейства,личия состоят в том, что ча"тота транспозиции транспозона Тп 5 в хр мосому этого штамма соответствует ; 2,0 10 -э а ауксотроАные мутанты оть ь5 бирают с частотой Оь 4 Я,Таким образом, предлагаемая плазмида рМТГ 59 проявляет температурную нестабильность при 37 ьСь что позволяет с высокой эМективностью вводить 10 транспозон Тп 5 (или Тп 9) в клетки любого штамма семейства ЕпйегоЬасйег 1 асеае и осуществлять транспозонный мутагегез с целью получения необходимых ауксотроАных мутантов. Предлагаемая плазмида рМТЕ 59 по сравнению с известными имеет следующие преимущества: не может реплицироваться в бактериях при 37 С, поэтому для отбора мутантов нет необходимости исполь зовать температуру 43 С, что значительно распиряет круг штаммов семейства ЕпегоЪасйегасеаеь которые можно использовать для транспоэонного мутагенеза с помощью данной плазмиды; 25 обеспечивает высокую частоту транспоэиции (доходящей до 1,3 10 -) транспозонов в хромосому новых бактериальных штаммов и отбор необходимых ауксотроАных мутантов. Плазмида рМТУ 59 мо жет быть использована для получения мутантов не только с помощью транспозона Тп 5, но также и второго транспозона (Тп 9), входящего в состав данной плазмиды. Плазмида рМТГ 59 предла/ Формула изобретения Плазмидная ЛНК рМТЕ 59, преднаэна ченная пля транспозонного мутагенеза бактерий семейства ЕпйегоЬасйегасеае молекулярной массой 40,8 М 1 ь,. и размером 61,2 т.п.н., содержащая плазмиду рМ 28 мол.м, 35,1 Мр и размером 52,7 т.п.н в которой Яша 1 - Есо 1471 участок мол.м. 4,6 Мя и размером 6,9 т.п.н., с уникальным сайтом для эндонуклеазы рестрикции Есо 1471 ь ответственен на репликацию и температурную нестабильность в бактериях семейства ЕпйегоЬасгег 1 а сеае;- транспозон Тп 5 мол,м. 3,9 Мд и размером 5,8 т,п,н.;- транспозон Тп 9 мол.м. 1,8 Мв и размером 2,638 т.п.н.;- генетические маркеры:- ген Кш ь (Тп 5) - устойчивость к канамицину;- ген Сш"(Тп 9) - устойчивость к хлорамАениколу;ген Яш " - устойчивость к стрептомицину;конъюгативна и может передаваться широкому кругу хозяев бактерий. Составитель С. БандринТехред М Моргентал Корректор К. Король Редактор Л. ВеселовскаяЗаказ 3123 Тираж 494 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5

Смотреть

Заявка

4445104, 20.06.1988

БЕЛОРУССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМ. В. И. ЛЕНИНА

ТИТОК МАРИНА АЛЕКСЕЕВНА, МАКСИМОВА НАТАЛЬЯ ПАВЛОВНА, ПРОКУЛЕВИЧ ВЛАДИМИР АНТОНОВИЧ, ФОМИЧЕВ ЮРИЙ КОНСТАНТИНОВИЧ

МПК / Метки

МПК: C12N 15/00

Метки: предназначенная, бактерий, днк, плазмидная, еnтеrовастеriасеае, мутагенеза, pmtf59, семейства, транспозонного

Опубликовано: 15.10.1990

Код ссылки

<a href="http://patents.su/3-1599434-plazmidnaya-dnk-pmtf59-prednaznachennaya-dlya-transpozonnogo-mutageneza-bakterijj-semejjstva-enterovasteriaseae.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентов СССР">Плазмидная днк pmtf59, предназначенная для транспозонного мутагенеза бактерий семейства еnтеrовастеriасеае</a>

Похожие патенты