Способ конструирования рекомбинантной плазмидной днк, кодирующей зимоген с человека

Номер патента: 1739854

Авторы: Брайан, Сау-Чи, Нилс, Хармут

Есть еще 12 страниц.

Смотреть все страницы или скачать ZIP архив.

Текст

(19) (1) СОЮЗ СОВЕТСНИХ СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ, РЕСПУБЛИК 51) 5 С 12 И 15/1 ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ОБРЕТЕНИЯ ИСАНИЕ АТЕН 20сА Аас стс стаНВ ЯЕВ ЬЕ 11 ЬЕ 11 10 5-Ата таа сАа ст 2 м-иет тВР ащ ье50 60 7080 90сс аас АсА ссА аст сст стт аАс тсА ата ттс тсс Аас Аас 6 А 6 саФеВ аьу тнВ РВО АьА РВО ьец АяР яеВ чАь Рне яеВ яеВ яеВ аы АВа20 2530(71) Эли Лилли ЭНД Компани(72) Нильс Ульрик Бэнп (БЯ), ХармутДжозеф Эрлих (РЕ), Брайан ВилльямГриннелл и Сау-чи Бетти ЯН (УЯ)(54) СПОСОБ КОНСТРУИРОВАНИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК, КОДИРУЮЩЕЙЗИМОГЕН С ЧЕЛОВЕКА(57) Изобретение относится к биотех.нологии и может бытьиспользованодля получения зимогенных Форм чело Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения зимогенных форм человечес-. кого белка С.Белок С - витамин К - зависимый плазменный белок играет важную роль при регулировании свертывания крови, Концентрация белка С является низкой при тромботических состояниях, таких как диссемилирующий внутрисосудисчый тромбоз, и при заболеваниях, располагающих к тромбозу, таких как большая 2веческого белка С. Способ конструирования рекомбинантной плазмидной ДНКкодирующей зимоген С человека, заключается в выделении фрагмента ДНК,кодирующего тяжелуюцепь белка С человека с последующимосуществлением сайтспецифического мутагенеза исубклонированием фрагмента ДНК с мутацией всоответствукшую плазмиду. При этомполучают плазмиды, кодирующие пойипептид, включающий легкую цепь белкаС человека, сигнальный пептид и пропептид=карбоксилированного секретируемого белка, дипептнд лизинар .гинин, аргинин "лизин или аргининф"аргинин и фрагмент ДНК, содержащиймутацию. 2 табл,травма, крупное хирургическое вмешательство и рак.Для облегчения понимания изобретения и активации белка С ниже представлена кодирующая последователь- ф ность и соответствующая аминокислот- . с ная последовательность человеческого (Д белка С. Эта аминокислотная последо- сО вательность и ее соответствующие час- Оф ти характеризуют также "нативный че- (Л ловеческий белок С" для целей пред- . Д лагаемого способа.30 4 ста ттс ата асс Асс т ЬЕц РНЕ ЧА 1. АЬА ТНВ Т Е19 173 25% сахарозы 50 мИ ЭДТА, прибавляют 1 мл 5 мг/мг раствора лизоцима; 3 мл О,25 И ЭДТА, рН 3,0 и 100 мкл 10 мг/ /мл РНК-азы А и проводят инкубирование во льду в течение 15 мин. 3 мл лизирующего раствора (3 мл 10% тритон-Х 100 у 75 мл 0,25 М ЭДТА, рН 8,0; 15 мл 1 М трис-НС 1 и 7 мл воды) прибавляют к обработанным лизоцимом клеткам, перемешивают и инкубируют на льду в течение 15 мин. Клетки замораживают в бане сухой лед - этанол, оттаивают центрифугируют в градиенте хлористого цезия. Выделяют плазмидную полосу, наблюдаемую в УФ-свете, Ппазмид-ДНК экстрагируют.1 мг ДНК плазмнды рНС 7 суспендируют в 1 мл ТЕ-буфера (10 мМ трис-НС 1, рН 7,6о и 0,1 мМ ЭДТА) и хранят при - 20 С,7 мкг ДНК плазмиды рНС 7 гидролизуют ферментом Язс 1, а затем рестриктазой Яа 1 1. Язс 1 - За 1 1 фрагмент экстрагируют сначала фенолом, затем хлороформом, собирают осаждением этанолом, центрифугируют и суспендируют в 15 мкл ТЕ/10-буфера (10 .мИ трис-основания, рН 7,6 и0,1 мМ ЭДТА)Смесь подвергают электрофорезу в 0,6% агарозном геле с низкой тем" пературой гелеобразования 2 - 3 ч приблизительно при 130 В и 65 мА в трис-ацетатном буфере. Гель окрашивают в растворе этидий бромида и полосу ДНК, составляющую около 0,7 т,п.о., вырезают из геля в виде маленького сегмента. Сегмент расплавляют инкубированием при 72 С,В объеме около 400 мкл получают приблизительно 0,5 мкг рестрикционного фрагмента Яза 1 - За 1 1 плазмиды рНС 7 длиной около 0,7 т.п,о. Дополнительную очистку ДНК проводят пропусканием раствора ДНК через колонку ИаСЗ-рге рас (ВВ 1.) в соответствии с инструкцией. Очищенный Фрагмент ресуспендируют в 15 мкл деионизированной воды.В. Конструирование рекомбинантного фага и удаление ДНК, кодирующей активационный пепаид, сайт-специфичным мутагенезом.Около 1 мкг репликативной формы. расщепления, разделяют в 0,6% гелеиз агазоры с низкой температурой ге 9854 20леобразования, больший фрагмент вырезают из геля и очищают.О, 1 мкг Бзс 1 - Яа 1 1 фрагментаплазмиды рНС 7 длиной около 0,7 т.п.о.лигируют с 5 мкл Бзс 1 - Ба 1 1 - обработанной И 13 ш р 18 КЕ ДНК в 2 мкл10 Х-лигазного буфера, (0,5 М трис-НС 1, .рН 7,8; 60,8 мМ ИБС 1 0,3 М-дитиот реитол /РТТ/), 2 мкл 1 мг/мл ВЯА1 мкл 25 мМ АТР, 1 мкл (около 400 ед.); Т 4-ДНК-лигазы (ЛЕВ) и 2 мкл воды.Около 300 мкл культивированнойв течение ночи культуры Е.со 1 К 12 15 М 101 используют для засевания 30 млч2 Х-ТТ-бульона (ТУ-бульон - это 10 г/лтриптона, 10 г/л НаС 1 и 5 г/л дрож-.жевого экстракта) и результирующуюокультуру инкубируют при 37 С и аэрировании до достижения 0.0 оо около0,5, Культуру 10 мин охлаждают на ледяной бане, собирают центрифугированием и снова суспендируют в 15 млхолодного 10 мМ ИаС 1, Клетки сновасобирают центрифугированием и суспендируют в 15 мл холодного 30 мИСаС 1 ; 200 мкл клеток отделяют, добавляют к 9 мкл полученной выше лигированной ДНК и инкубируют на льду ЗО приблизительно 30 мин. Затем ДНК-клеточную смесь инкубируют при 42 С2 мин и прибавляют. к 3 мп топ-агара(ТУ-бульон с 0,5% агара, поддерживаемого в виде расплава при 45 С),содержащего также 50.мкл 2% Х-Са 1(Х-Ца 1 это 5-бром-хлор-индолилЭ-галактопиранозид), 50 мкл 100 мМАРТО (ХРТС - это изопропил-ф-П-тиогалактопиранозид) и 100 мкл Е,со 1 46 К 12 1 И 101 в логариФмической фазе роста, Затем смесь топ-агар/клетки по"мещают на ТУ-агаровые пластинки и инкубируют пластинки ночь при 37 С.оНа следующее утро четыре явные 45 колонии раздельно используют для засева 2 мл 2 Х ТУ-бульона и результирующие культуры инкубируют при 37 ОСи аэрировании б ч. Затем культурыцентрифугируют и 500 мкл результирующего супернатанта (клеточную массуиспользуют для получения фаговой ДНК для анализа с помощью рестриктаз) прибавляют к 500 мкл культуры (О.Р.О = 0,5) Е.со 11 К 12 Ц 1101 и .50 мп 2 Х ТУ-бульона. Эти культуры ин-: кубируют ночь при 37 С. КР ДНК фага выделяют из клеточной массы по упрощенной методике по примеру 1 А без антибиотика в культуральной среде и1739854 21 22 5 10 5 -ССССАСТСАССТСАААССАСТСАТТСАТСССААСАТСАстадии ультрацентрифугирования заменяют экстракциями фенолом и хлороформом, Трансформанты содержащие ДНК: Фага М 13 ш р.18-НЕ 1, идентифицируют рестрикционным ферментным анализом их фаговой ДНК.После ночи культуры центрифугируют и к 5 мл супернатанта прибавляют около 1 мл раствора, содержащего 20 3 . полиэтиленгликоля .(РЕС) 6000 и 2,5.мМ ИаС 1, и инкубируют 10 мин при комнатной температуре. Смесь центрифугируют, результирующий осадок, содержащий однонитевую ДНК фага М 13 ш р 18-ПЕ 1, снова суспендируют в 500 мкл ТЕ 8-.,буфера (20 мМ трис-НС 1, рН 7,5; О, 1 МЭДТА; 10 мМ ИаС 1). Раствор ДНК 30 пмоль этого фрагмента индивидуаль" но обрабатывают 5 ед. Т 4-полинуклеотидкиназы в 10 мкл. 1 Х-киназного буфера (100 мМ трис-НС 1, рН 8,3, 10 мМ ЭПТ; 100 мМ М 8 С 1 ), содержащего 1 мкл 1 мМ АТР, 30 мин при 37 С и затем инкубируют 10 мин при 65 С и замораживают, Обработанные киназой ДНК используют для описываемого ниже мутагенеза.На первой стадии мутагенеза мутагенный олигонуклеотид и универсальный праймер М 13 ренатурируют в одноните- вую фаговую ДНК. Ренатурирование .проводят, прибавляя 300 нг (0,5 мкл) однонитевого фага М 13 шр 18-НЕ 1 к 1 пмоль (1,2 мкл) универсального праймера, 1 пмоль (0,3 мкл) мутагенного олигонуклеотида, 2 мкл 10 Х-ренатурационйого буфера (100 мМ трис-НС 1, рН 7,5;1 мМ ЭДТА и 500 мМ МаС 1) и 16 мкл воды, инкубируют смесь при 80 С 2 мин и затем 5 мин при 50 С, затем даютосмеси остыть до комнатной температуры.После ренатурации олигонуклеотидов фаговую ДНК делают двунитевой, расширяя праймеры ДНК-полимеразой. Эту реакцию проводят, прибавляя 3 мкл 10 Х-расширяющего буфера (500 мМ :трис-НС 1, рН 8; 1 мМ ЭДТА и 120 мМ М 8 С 1 ); 3 мкл 10 Х-лигазного буфера;1,3 мкл 0,2 мМ ЭТТ; 3 мкл. йЖТР-смеси (0,5 мИ каждой ЧБТР); 1,2 мкл 25 мМ АТР; 0,5 мкл фермента Кленова (5 ед//мкл, ВМВ); 1 мкл Т 4"ДНК-лигазы(400 ед., НЕВ) и 19,8 мкл воды к сме си ренатурированной ДНК. Расширение 25 30 35 40 45 экстрагируют сначала хлороформом, за тем дважды ТЕ-насыщенным Фенолом и затем снова хлороформом. Однонитевую ДНК осаждают с помощью ЮаОАс и этанола, центрифугируют, промывают 70- ным этанолом.Осадок высушивают и растворяют в 80 мкл воды. Этот образец фага используют на следующей стадии сайт- . специфичного мутагенеза для удаления ДНК, кодирующей активационный пептид. фмагмент аднонитевой ДНК, используемый для мутагенеза при удалении ДНК, кодирующей активационный пептид, получают на автоматическом ДНК-синтезаторе в следующем виде: проводят инкубированием при комнатной температуре в течение 30 мин,озатем 4 ч при 37 С и в течение ночи при 4 С.Реакцию останавливают экстракцией . фенол-хлороформом и ДНК осаждают этанолом с ацетатом натрия (БаОАс). ДНК собирают центрифугированием, суспендируют в 40 мкл 8 Х-буфера (0,3 М БаС 1; 0,03 М ИаОАс, рН 4,5 и 0,3 мМ ЕпС 1) и. прибавляют к раствору ДНК. Установлено, что 81-обработка не об.- ладает существенными преимуществами и в методиках конструирования, описываемых в последующих примерах, 81-обработка полностью исключена.Раствор ДНК разделяют в две пробирки на две равные части и в одну из пробирок прибавляют 100 ед. (ВМВ) 81-нуклеазы. 81-реакцию проводят ин- кубированием 5 мин при комнатной температуре и останавливают зкстрагированием реакционной смеси ТЕ-насыщенной смесью фенол-хлороформ (50:50). Осадок ДНК суспендируют в 60 мкл воды и трансформируют в Е,со 1 ь К 12 1 М 101 Мутантов отбирают с помощью радиоактивно меченного . мутагенного олигонуклеотида, .5 ТС АААССАСТСАТТСАи точечных гибридизаций. Несколько положительно гибридизированных пятен отбирают и высевают в 2 мл культуры Е.со 1 х К 12 1 М 101, находящейся в логарифмической стадии роста. Культуры инкубируют .при 37 Со и аэрировании около 6 ч и затем используют для получения однонитевой ДНК.Однонитевую ДНК секвентируют, Несколько Фагов идентифицируют целевой мутацией, Фаг, в котором удапена последовательность, кодирующая активационный пептид, это целевой фаг М 13 шр 1 В-НЕ 2. Мутация в фаге М 13 шр 18-НЕ 2 вызывает уменьшение размера на 36 пар оснований по сравнению с природной кодирующей последовательностью и эту разницу можно использовать для идентификации ДНК, содержащей мутировавший.участок. КР-форму. фага М 13 шр 18-НЕ 2.получают последующим конструированием.С. Конструирование плазмиды рЬАРС из Фага М 13 шр 18-НЕ 2 и плазмиды рЬРС.Ззс 1 - Ба 1 1 фрагмент (около 0,7 т,п.о.) КГ-формы фага М 13 шр 18-НЕ 2 отрезают от фага и выделяют по методике примера 1 А.Три ДНК-фрагмента связывают вместе с получением плазмиды рЬАРС: Бзс 1 - За 1 1 Фрагмент фага М 13 шр 18-НЕ 2 (около 0,7 т,п.о.) и 2 ДНК-фрагмента плазиицы рЬРС. Поскольку в.плазмице рЬРС находятся сайты рестриктаз Ба 1 Х, Ззс 1 и Есо КХ, то целевые рестрикцнонные фрагменты Есо КХ - Ба 1 1 и Есо КХ - Бзп 1 нужно получать двумя отдельными расщеппениями.Ззс 1 - Есо К 1 расщепленную ДНК суспендируют в воде и помещают в 0,6 гель из агарозы с низкой температурой гелеобразования для отделе". ния ДНК-Фрагментов.Для получения ЕсоК Х в . Ба 1 1- фрагмента, около 15 мкг плазмиды рЬРС сначала обрабатывают рестрикционным ферментом Ара 1 для удаления загрязнений близкими по размераж, рестрикционными фрагментами. Затеи рестриктазы За 1 1 ЕсоК 1 добавляют к раствору Ара 1-расщепленной ДНК плазийды рЬРС и результирующую смесь инкубируют.,.Ара 1-За 1 1-ЕсоК 1 расщепленную ДНК плазмиды рЬРС сначала экстрагируют фенолом, затем хлороформом, собирают осаждением этанолом и цент" рифугированием. Суспендируют вводе помещают в 0,67 агароэный .гель и раз-, деляют электрофорезои. Рестрикционные фрагменты ЕсоК 1 -.За 1 1 (около 376 т,п.о.) и ЕсоК 1 Ззс 1,(около 2,0 т.п.о.) вырезаютиз геля и выделяют.У Кголый из двух очищенных рестрикционных фрагментов прибавляют к Бзп 1 - Ба 1 1-рестрикционногз фрагмента (около 0,7 т.п,о.) фага М 13 шр 18-. НЕ 2 и лигируют, получая в ре-, зультате целевую плазмиду рЬАРС. Плазиида рЬАРС отличается от плазмиды рЬРС отсутствием ДНК, кодирующей1 О активационный пептид.Плаэмиду рЬАРС трансформируют вЕ.со 1 х К 12 КЧ 308 и выращивают.Трансформанты Е.со 1 К 12 КЧ 308//рЬАРС подтверждают рестрикционнымФерментным анализом. Ппазмидную ДНКполучают из трансформантов Е.со 13.К 12 КЧ 308/РЬАРС практически так же,.как в примере 1 А, за исключениемтого, что в качестве селектийного 20 агента используют 50 мкг/мл ампициллина, а не тетрациклина.П. р и м е р 2. Конструированиеплазииды рЬРС.Плазмиду рЬРС используют как про иежуточный вектор при конструированииплазмиды рЬАРС. Плазмида рЬРС содержит сегмент ДНК, кодирующий ВК.-вирусный усилитель и поздний промотор аденовируса 2, ведущие экспрессию человеческого белка С. Конструирование плазмиды рЬАРС в основном приводит к замене последовательности, кодирую" щей человеческий белок С в плазмидерЬРС, на другую. последовательностькодирующую белок С, на которой удалена ДНК, кодирующая активационный пептид.В примере 2 В описано конструирова-.ние плазмиды рВК пео 1, получаемой 40вставкой ВК-усилителя в плазмидурйВРЧ-ИМТ пео. В примере 2 С описаноконструирование плазмиды рЬРсас, получаемой вставкой позднего промоторааденовируса 2 в плазмиду рЗЧ 2 сас.43примере 2 Р описано конструированиеплазмиды рВЬсас, содержащей ВК-усилитель для повышения активностипозднего аденовирусного промотора. Впримере 2 Е описано конструированиеплазмиды рЬ 133, вектора экспрессиибелка С, начиная с исходной плазмидырНС 7 через Конструирование промежуточной плазмиды рЗЧ 2-НРС 8 и результирующее конструирование промежуточной плазмиды рЬРСсодержащей конт. ролирукщую экспрессию последовательность ВК-усилитель (аденовирусныйравления экспрессией человеческогобелка С),А. Получение ВК-вирусной ДНК,ВК-вирус получают из КоллекцииКультур Американского Типа, номерАТСС Ч 1-837, Организмом-хозяином дляполучения ВК-вирусной ДНК являетсякультура клеток человеческой эмбриональной почки (РНЕК),Вирус выделяют из клеток тремяциклами замораживания-оттаивания иклеточные остатки удаляют центрифуги"рованием. Вирус осаждают, собираютдобавлением ПЭГ - 6000, инкубируют24 ч при .4 С.и центрифугируют. Осадок растворяют в О, 1 Х БИС-буфере(1 Х ЯЗС О, 15 М БаС 1 и О, 015 М цит-.рат натрия, рН 7) при 1/100 первоначального объема. Вирусную суспензиюцентрифугируют, при этом наблюдаютдве полосы. Нижнюю полосу, содержащую полный вирион, собирают и обессоливают на колонке с сефадексом С,Додецилсульфат натрия прибавляютк раствору очищенных вирионов, полученных после колонки, до конечнойконцентрации 1%; прибавляют протеазув концентрации 100 мкг/мл и раствороинкубируют 2 ч при 37 С. Затем краствору прибавляют хлорид цезия доплотности 1,56 г/мл и этидий бромиддо .концентрации 100 мкг/мл. Растворцентрифугируют, После центрифугирования полосу вирусной ДНК выделяюти 5 раз экстрагируют изоамиловымспиртом, насыщенным 100 мМ трис-НС 1,рН 7,8. Затем раствор ВК-вирусной ДНКдиализуют против ТЕ-буфера до достижения отношенияпоглощения ДНК при260 нм/280 нм, равного 1,75 - 1,90.ДНК осалдают, доводя концентрациюБаС 1 до О, 15 М, добавляют 2 объемаэтанола, инкубируют раствор не менее2 ч при -70 С и центрифугируют 10 минопри 12000 н. Результирующий осадокВК-вирусной ДНК суспендируют в ТЕбуфере в концентрации 1 мг/мл.В. Конструирование плазмиды рВКпео 1.Клетки Е.со 1 К 12 НВ 101/рдВРЧ -ММТ пео получают в лиофилизованнойформе из Коллекции Культур Американского Типа под номером АТСС 37224,Лиофилизованные клетки помещают наЬ-агаровые пластинки, содержащие100 мкг/мл ампициллина, и инкубируютпри 37 С с получением изолятов едиоНИЧНОЙ КОЛОНИИ, 510 1 л Ь-бульона, содержащего 50 мкг/ /мл ампициллина, засевают колонией Е.со 1 д К 1,2 НВ 101/рйВРЧ-ММТ пео и инокубируют при 37 С до достижения 0.0.9 О, равной приблизительно 1 г. К культуре прибавляют 150 мг хлорамфеникола. Инкубирование продолжают приблизительно 16 ч; добавка хлорамфениколаингибирует синтез белка идальнейшее деление клеток, но позволяет продолжаться репликации плазмид. Из культуры получают плазмидную ДНК рйВРЧ-ММТ пео по методике, описанной в примере, 1 А.ДНК плазмиды рйВРЧ-ММТ пео расщепляют рестриктазой, ВапН 1. ВашН 1 ВапН 1 фрагмент ДНК осаждают, собирают центрифугированием и суспендируют,ВашН 1 - ВашН 1 фрагмент плаэмидырйВРЧ - ММТ пео (1 мкл) и ВааН 1ВашН 1 фрагмент ВК-вирусной ДНК лигируют Т 4-ДНК лигазой. ЛигированнуюДНК трансформируют в клетки Е.со 1 дК 12 НВ 101.Трансформированные клетки помещаютна Ь-агаровые пластинки, содержащие100 мкг/мл ампициллина. ТрансформантыЕ.со 1 х К 12 НВ 101/рВКпео 1 и Е, со 11К 12/рВК пео 2 идентифицируют рестрик- .ционным ферментным анализом.С.Конструирование плазмиды рЬРсаС,промежуточной плазмиды для конструирования плазмиды рВЬса.35 Вирионная ДНК аденовируса 2 (А 62)является двунитевой линейной молекулой длиной около 35,94 т.п.о. Позднийпромотор Ай 2 можно выделить в рестрикционном фрагменте АссХ - Рти 1140 (около 0,32 т,п.о,) генома А 62; этотрестрикционный фрагмент соответствуетпоследовательности между нуклеотидами 5755 и 6071 генома Ай 2, дляего выделения.ДНК А 62 сначала рас щепляют рестриктазой Ва 1 1 и выделяютВа 1 1 - рестрикционный фрагмент длиной около 2,4 т.п.о., содержащийвсю последовательность АссТ - Рчп Е 1рестрикционного фрагмента длиной око ло 0,32 т.п.о. Затем рестрикционныйФрагмент Ва 1 1 длиной, около 2,4т.п.о. расщепляют Асс 1 Рчц И с получением целевого фрагмента.ДНК АЙ 2 (полученной от ВКЬ) обрабатывают рестриктаэой Ва 1 1, подвергают электрофорезу до разделениярестрикционных фрагментов.Ва 1 1 - рестрикционный фрагментАЙ 2 длиной около 2,4 т.п.о. расщеп9854 28 5 10 15 20 25 40 45 50 55 27 173Ю ляют вначале рестриктазой Асс 1, затем рестриктазой Рчи 11, наносят на 6%-ный полиакриламидный гель и подвергают электрофореэу до отделения АссТ - Рчц 11 - рестрикционного фрагмента длиной около 0,32 т.п.о., содержащего пОздний промотор АЙ 2.Для превращения Асс 1 - Рчц 11 рестрикционного фрагмента в Асс 1 " Вс 1 1 в . рестрикционный фрагмент Вс 1 1 " линкеры связывают с рестрикционным Фрагментом Асс 1 - Рчц 11 дли,ной около 0,32 т,п.о. Поскольку Вс 1 1-линкеры имеют тупые концы, то они присоединяются только к Рчц Т 1- окончаниям рестрикционных фрагментов, Линкеры Вс 1 1 имеют следующую последовательность:5 -СТСАТСАС 3 -САСТАСТС 0,25 мкг обработанных киназой Вс 1 1-линкеров прибавляют к раствору Асс 1 - Вчц 11-рестрикционного фрагментадлиной около 0,32 т.п.о., затем добавляют 1000 ед. Т 4-ДНК-лигазы и 1 мкл 10 Х лигазного буфера и результирующую смесь инкубируют ночь при 16 С. Линкеры Вс 1 1 могут связываться только с Рчц 11-концом рестрик" ционного фрагмента Асс 1-Рчц 11, Последующее ДНК-секвентирование показывают, что 4 Вс 1 1-линкера присоединены к Рчц 11-концу рестрикционного фрагмента АссТ-Рчц Т 1. Эти дополни" тельные Вс 1 1-линкеры можно удалить Вс 1 1-отщеплением и повторным связыванием; однако дополнительные Вс 1 1- линкеры не удаляют, поскольку они не мешают правильному функционированию векторов, содержащих эти линкеры.Клетки Е.соИ. К 12 НВ 101/рЗЧ 2 сас получают в лиофилизованной форме от АТСС под номером АТСС 37 155, и плаз" мидную ДНК рЗЧ 2 саг выделяют. ДНК плазмиды рБЧ 2 саг лигируют вначале рестриктазой Асс 1, а затем рестриктазой Зсц 1АссТ - Бгц 1 фрагмент ДНК плазми- ды рБЧсай смешивают с Асс 1 - Рчи 11 фрагментом Ад 2,. имеющим присоединенные Вс 1 Т-линкеры,лигируют и трансформируют в Е.со 1 К 12 НВ 101. Связанная ДНК является целевой плаэмидой рЬРсас, содержащей поздний промотор АЙ 2, расположенный так, чтобы управлять транскрипцией и экспрессией хлорамфениколацетилтрансферазного гена. О. Конструирование плазмиды рВ 1 сас.ДНК плазмиды рВК по 1 расщепляют ферментом Асс 1 и с помощью агарозного геля выделяют фрагмент длиной около 1,4 тп.о., содержащий ВК-усилитель.5 мкг фрагмента расщепляют рестриктазой Рча 11. Фрагмент Рчп 11 ДНК выделяют, очищают и подготавливают к связыванию.ДНК плазмиды рЬРса гидролизуют вначале рестриктазой Асс 1, .а затем рестриктазой ЗСЮ . ДНК плазмиды рЬРсас несколько раз осаждают этанолом для очистки Асс 1 - Зси 1-рестрикционного фрагмента длиной около 4,81 т.п.о., содержащего Е.со 1.- источник репликации и поздно промотор АЙ 2.Асс 1 - Зси 1 - фрагмент плазмиды рЬРсас лигируют с Асс 1 в :. Рчц 11- Фрагментом (1.,28 т.п,о.) плазмиды рВК пео 1. Связанная ДНК составляет целевую плазмиду рВЬсас,Связанную ДНК используют для трансформирования клеток Е.соЦ К 12НВ 101. Траисформанты Е.со 1 д К 12 НВ 101//рВЬсас идентифицируют рестрикционныманализом.Е. Конструирование плазмиды рЬ 133,Плазмида р 1 133 представляет собой вектор экспрессии человеческого белкаСе5,0 мкг дНК плазмиды рНС/ смешивают с 50 ед. рестриктазы Вап 1,10 мкл 10 Х Вап 1 - реакционного буфера (1,5 М МаС 1 60 мМ трис-НС 1,рН 7,9 Ф 60 мМ МБС 1 и 1 мг/мл ВБА),35 мкл воды и инкубируют. Расщепленную ДНК плазмиды рНС 7 подвергаютэлектрофорезу в 3,5% полиакриламидномгеле. Из геля вырезают участок, содержащий Вйп 1 - рестрикционный фрагмент, длиной около 1,25 т.п,о., помещают в испытательную пробирку и из. - мельчают. 1 мл экстракционного 6 Ъ Фера (500 мМ ЮНОАс, 10 мМ МяОАс, 1 мМ ЭДТА, 1% ЗИ и 10 мг/мл т-РНК) добавляют к частицам и пробирку вьг держивают ночь при 37 С. Остатки удаляют центрифугированием и супернатант переносят в новую пробирку. Супернатант пропускают через стекловату, прибавляют 2 объема этанола и смешивают, Результирующий раствор помещают на 10 мин в сухой лед - эта510 25 30 а затем рестриктазой Яа 1 1, Смесь наносят на 3,57.-ный полиакриламидныйгель и подвергают электрофорезу доотделения целевого рестрикционногофрагмента Ндпд 111 - Ба 1 1 длиной 35около 0,29 т.п.о.ДНК плазмиды рЯ 7 2-НРС 8 гидролизуют вначале рестриктазой В 81 11, азатем рестриктазой Ба 1 1. Смесь наносят на 3,5 Х полиакриламидный гельи подвергают электрофорезу до отделения целевого рестрикционного фрагмента Яа 1 1 - В 81 11 длиной около1,15 т.п.о,45ДНК плазмиды рБ 72-Р-глобин (ЯВИВ 15928) гидролизуют рестриктазамиНхпй 111 и В 81 11, После расщепленияреакционную смесь наносят на 17-ныйагарозный гель и фрагменты разделяютэлектрофорезом. Из геля выделяют целевой рестрикционный фрагмент Нпс111 - В 81 11.Нпй 111 в . Яа 1 1 фрагмент плазмиды рБЧ 2-НРС 8, длиной около 029 55т,п.о., Ба 1 1 - Вя 1 11 фрагмент плазмиды рБ 7 2-НРС 8 длиной около 1,15т.п.о. и 2 мкл Нпй 111 - В 81 11фрагмента плазмиды рБУ 2-,-глобинлигируют Т 4-ДНК-лигазой. Связанная нол и ДНК осаждают центрифугированием.Очищенный фрагмент суспендируютв 10 мкл ТЕ-буфера и хранят при-20 С, Рестрикционный фрагмент Вап 1модифицируют добавлением линкера дляконструирования плазмиды рБ 72-НРС 8.Необходимый линкер имеет следующую структуру:5 -АССТТТСАТСАС 3-ААСТАСТССАСС 8 мкг Вап 1-фрагмента длиной около 1,25 т.н.о. добавляют и смешиваютс 500 пмоль линкера и лигируют,ДНК выделяют и растворяют в Ара 1 -реакционного буфера и гидролизуютрестриктазой Ара 1, ДНК осаждают.Осадок ДНК растворяют и гидролиэуютрестриктазой Нпй 111. Нпй 111 - 20Ара 1 - рестрикционный фрагмент выделяют с помощью электрофореза в геле, 5 мкг целевого фрагмента суспендируют в 10 мкл ТЕ-буфера и хранятпри -20 С,ДНК плаэмиды рНС 7 гидролизуютрестриктазой Рзс 1 буфера (1,0 ММаС 1; 100 м М трис-НС 1, рН 7,5;1,00 мМ МЯС 1 и 1 мг/мл ВБА) и 35 мклводы и инкубируют 2 ч при 37 С, подвергают электрофорезу в 3,57-ном по-.лиакриламидном геле, целевой фрагментдлиной около 0,88 т.п.о очищают,суспендируют .в 10 мкл ТЕ-буфера ихранят при -20 ОС,5 мкг Рзй 1-фрагмента длиной около 0,88 т.п.о. смешивают с 50 мклследующего линкера, который конструируют на автоматическом ДНК-синтезаторе:5-СТСАТСАА 3 -АССТСАСТАСТТСТАС Смесь лигируют с помощью Т 4-ДНКлигазыДНК осаждают, растворяют и гидролизуют вначале рестриктазой Ара 1,а затем рестриктазой Вя 1 11, наносятна 3,5 Е-ный полиакриламидный гель ицелевой рестрикционный фрагмент Ара 1В 81 11 длиной около 0,39 т.п.о. вы"деляют.ДНК плазмиды рБЧ 28 р (АТСС 37145)гидролизуют вначале рестриктазойНпЫ 111,. а затем рестриктазой Вя 1 11,После расщепления В 81 11 реакционнуюсмесь. наносят на 17-ный агарозныйгель и фрагменты разделяют электрофореэом. Гель окрашивают этидий бромидом, полосу, соответствующую целевому фрагменту Н 1 пй 111 - В 81 11 длинойоколо 5,1 т.п.о вырезают из геляи помещают в диализную пробирку иэлектрофорез продолжают до выходаДНК из агарозы. Буфер, содержащийДНК из диализной пробирки, экстрагируют фенолом и хлороформом и осаждают ДНК,Осадок суспендируют в10 мкл ТЕ-буфера и получают приблизительно 5 мкг целевого рестрикционного фрагмента Н.пй 111 - В 81 11 плазмиды рБ 72 яр длиной около 5,1 т.п.о.Н 1 пй 111 - Ара 1 фрагмент длиной .1,23 т.п.о., Ара 1 - В 81 11 фрагмент длиной О, 19 т.п.о. и Нпй 111 - В 81 11 фрагмент смешивают и лигируют. Полученная ДНК является целевой плазмидой рЯ 72-НРС 8. Клетки Е.со 13. К 12 КВХ (ШК 1.В.5210) трансформируют лигазной смесью и помещают на Ь- агаровые пластинки, содержащие 100 мкг/мл ампициллина. Затем пластинки инкубируют при 37 С. Наличие трансформантов Е.со 1 х К 12 КК 1/рБЧ 2-НРС 8 подтверждают рестрикционным ферментным анализом.50 мкг плазмиды рЯЧ 2-НРС 8 гидролизуют вначале рестриктазой Ндпд 11132 1739854 АССССССССССТСАТТСАТС 35 40 50 ДНК является целевой плазмидой рЬ 133. Связанную ДНК используют для трансформирования Е.со 11. К 12 КК 1 и целевые трансформанты Е,со 1 К 12 КК 1/ /р 1.133 идентиФицируют по их ампициллин-устойчивому фенотипу и с помощью рестрикционного анализа.Г. Конструирование плазмиды РЬРС из плазмид р 1.133 и рВЬсас,ДНК плаэмиды рВЬсас гидролизуют рестриктазой Н 1 пс 1 111, отделяют в агарозном геле фрагмент длиной около 0,87 т.п.о., содержащий ВК-усилитель и поздний промотор АЙ 2.ДНК плазмиды рЬ 133 гидролизуют рестриктаэой Нхпд П 1, смесь инкубируют 2 ч при 37 С, Затем ДНК разбавляют до 100 мкл, обрабатывают 0,06 ед, телячьей кишечной щелочной фосфатаэы, дважды экстрагируют фенолом и один раз хлороформом, осаждают этанолом и снова суспендируют в 10 мкл ТЕ-буфера.Н 1.пй 111 Фрагмент (длиной около О, 87 т.п.о.) плаэмиды РвЬсас прибавляют к, НпЫ 111- обработанной плазмиды р 1,133 и лигируют. Связанная ДНК составляет целевую плазмиду РЬРС.5-САССЛАСААСАССААСТ Иутагенизированный фаг, полученныйсайт-специфичным мутагенезом, названМ 13 шр 18-НЕ 4.Конструирование плазмиды рЬРС -167 С проводят аналогично конструированию плазмиды рЬАРС, описанному впримере 1 С. Однако плазмиду РЬАРСконструируют с использованием двухрестрикционных Фрагментов из плазмиды РЬРС. При конструировании плазми. ды РЬРС - 1670. эти же фрагменты получают из плазмиды рЬАРС. Причинойиспользования плаэмиды РЬАРС в,качестве,источника Фрагментов, вместоплазмиды р 1,РС является облегчениерестрикционного анализа при идентификации трансформантных плазмидРЬРС - 167 С, Так как плазмиды р 1 РС ир 1.РС в , 167 С очень близки по размерам, то трудно различить плазмидуРЬРС от плазмиды РЬРС 167 С,Однако, поскольку плазмида р 1 АРСменьше, чем плаэмида РЬРС - 1676,то, получая два фрагмента из плазмиды РЬАРС, можно легко отличить родителя (плазмиду р 1 АРС) от целевой. плазмиды РЬРС - 1676, Таким образом,5 10 15 20 Связанную ДНК используют длятрансформирования Е,со 1 К 12 НВ 101,Трансформированные клетки помещаютна Ь-агаровые пластинки, содержащиеампициллин, и ДНК устойчивых к ампициллину трансформантов проверяютрестрикционным анализом. Рестрикционньй фрагмент Нпй 111 длиной около0,8 т,п.о., кодирующий ВК-усилитель и поздний промотор АЙ 2, можетвстроиться в Н 1 пй 111 - расщепленнуюплазмиду рЬ 133 в одной из двух ориентаций, лишь одна из которых даетплазмиду рЬРС.П р и м е р 3, Конструированиеплазмиды р 1 РСС.Плазмиду рЬРСС конструируютв соответствии с сайт-специфичныммутагенезом и другими методиками, использованными при конструированииплазмиды рЬАРС, как это описано впримере 1,1 При конструировании плазмиды рЬРС - 167 С фаг М 13 шр 18-ИЕ 1 (см. пример 1 В) подвергают сайт-специфичному мутагенезу с йомощью следующего мутагенизирующего олигонуклеотида; при конструировании плазмиды РЬРС -1670 рестрикционный.фрагмент Яз 1 Яа 1 1 длиной около 0,7 т.п.о. фагаМ 13 шр 18-НЕ 4 связывают с рестрикционпым фрагментом ЕсоК 1 - Яа 1 1 длинойоколо 3,76. т.п.о. плазмиды РЬАРС ирестрикционным фрагментом ЕсоК 1 Яз 1 длиной около 2,0 т.п.о. плаэмиды РЬАРС. Связанная ДНК составляет целевую плазмиду РЬРС - 167 С, трансформирующую Е,со 1 К 12 КЧ 308. Результирующие трансформанты Е.со 1 т К 12 КУ 308/рЬРС - 167 С используют для получения больших количеств, ДНК плазмиды р 1 РС - 1670,П р и м е р 4. Конструирование плазмиды РЬРС - 167 РПлазмиду рЬРС - 167 Р конструируют практически так же, как описано в примере 1 для конструирования плазмиды р 1 АРС с использованием сайт-специфичного мутагенеза и других стадий. Цри констРуировании плазмиды РЬРС.167 Р фаг М 13 шр 18-НЕ 1 подвергают сайт-специфичному мутагенезу с ис.". пользованием следующего мутагенизирующего олигонуклеотида:Мутагенезированный фаг, получившийся в результате сайт-специфичного му" тагенеза, назван М 13 шр 18-НЕ 5.Финальное конструирование плазмиды рЬРС - 167 Р проводят аналогично конструированию плазмиды рЬАРС, описанному в примере 1 С. Однако плазмиду рЬАРС конструируют с использованием двух рестрикционных фрагментов из плазмиды рЬРС. В отличие от этого при конструировании плазмиды рЬАРС - 167 Р эти же два фрагмента получают из плазмиды рЬАРС. Причиной использования плазмиды рЬАРС в качестве источника фрагментов вместо плазмиды рЬРС является облегчение рестрикционного анализа при идентифицировании трансформантов плазмиды рЬРС 167 Р. Поскольку плазмида р 1 АРС меньше, чем плазмида рЬРС - 167 Р, то, получая два фрагмента из плазмиды рЬАРС, можно легко отличить родительскую плазмиду ГрЬАРС) от целевой плазмиды рЬРС - 167 Р.Таким образом, при.конструировании рЬРС - 16 Р рестрикционный фрагмент БзС 1 - Ба 1 1 длиной около 0,7 т.п.о. фага М 13 шр 18-НЕ 5 связывают с рестрикционным фрагментом ЕсоК 1 - Ба 1 1 плазмиды рЬАРС длиной около 3,76 т.п,о. и с рестрикционным фрагментом ЕсоК 1 - Бзй 1 длиной около 3,6 т.п.о., и с рестрикционным фрагментом ЕсоК 1 - Бзй 1 длиной около 2,0 т.п.о. плазмиды рЬАРС. Связанная ДНК составляет целевую плазмиду рЬРС - 167 Р, которую трансформируют в Е.со 1 д К 12 КЧ 308. П р и м е р 5. Конструирование трансформированных аденовирусом человеческих эмбриональных почечных клеток линии 293 и трансформированных аденовирусом трансформантов клеток сирийского хомяка линии АЧ 12 с ис-, пользованием плазмиц рЬРС - 1670 и . рЬРС - 167 Р.Человеческие эмбриональные почечные клетки линии 293 получены от Коллекции Культур Американского Типа под номером АТСС СКЬ 1573. Трансформированные аденовирусом клетки сирийского хомяка линии АЧ 12 также могут быть получены из Коллекции Культур Американского Типа, где они хранятся под Р АТСС. СКЬ 9595. Клетки 293 выращивают в минимальной среде Игла с 103-.ной термоинактивированной лощадиной сывороткой прио37 С Гсреду меняют дважды в неделю).Среда состоит из Э МЕМ с 107 теля-.чьей сыворотки, 50 мкг/мл ентамицина 10 и 10 мкг/мл Агнца МЕРНУТОИ фитандиона витамина К 1, Клетки субкультивируют удалением среды, промывают раствором Хенка, прибавляют 0,257.-ныйтрипсин Гсодержащий 0,2 г/л ЭДТА) 15 на 1-2 мин, промывают свежей средой,отсасывают и распределяют в новыесосуды с отношением субкультивирования 1:5 или 1:10.За 1 день перед трансформированиемклетки высевают в количестве 0,х 10 бклеток на 100 мм чашку Петри, Стерильную, осажденную этанолом плазмиду ,ДНК растворяют в ТЕ-буфере и используютдля получения раствора 2 Х ДНК-СаС 1,содержащего 25 мкг/мл трансформирующей плазмидной ДНК Гпри трансформа.циях плазмидами РЬРС - 167 Р илирЬРС - 167 С обычно используют две,плазмиды, плазмиду рЬРС - 167 Р или 30 рЬРС - 167 С и плазмиду, содержащуюселективный маркер) и 250 мМ СаС 1.Получают 2 ХНВББ, содержащий 280 мМИаС 1, 50 мМ НереБ и 1,5 мМ фосфатнатрия с рН, доведенным до 7,05 -7,15. Раствор 2 Х ДНК - СаС 1 по каплям прибавляют к равному объему стерильного 2 Х НВББ и продувают пузырьками в ходе прибавления ДНК, Позволяют формироваться ДНК-кальцийфосфат ному осадку без перемешивания 30 -45 мин при комнатной температуре.Затем осадок осторожно перемеши"вают отсосом пластиковой пипеткой и1 мл Гна пластинку) осадка прибав ляют прямо в 10 мл среды, роста, покрывакщей реципиентные клетки. Через4 ч инкубирования при 37 С среду заменяют свежей и клетки инкубируют еще72 ч до проведения селекции. Для 50 плазмид, не содержащих селективногомаркера, функционирующего в эукариотных клетках, таких как плазмидарЬРС - 167 Р или рЬРС - 167 С, в методике трансформирования используют 55 следуюп 1 ую смесь плазмид: вектор экспрессии ко данному изобретению, несодержащий селективного маркераевектор экспрессии, содержащий селективный маркер, работааций, в эукариот36 1739854 СС АСТСАТТСАТСССААСАТСАс образованием Фага И 13 шрПНЕ 2 или 5-САССААСААСАССААСТАССССССССССТСАТТСАТС-Зф с образованием Фага шр 18 НЕ 4 или 5 -САССААСААСАССААСТАТТССССССССТСАТТСАТСных клетках, Для трансформации использовали плазмиды рБЧ 2 - Юг(АТСС 37146), рБЧ 2 - пео (АТСС37149), рБ 72 - дрй (АТСС 37145) ирБ 72 - Ьуя (ИКБЬ В 18039). ПлазмидарБ 72 - Ьур придает устойчивость эукариотным клеткам-хозяевам к гидромицину В Таким образом методикасовместной трансформации позволяетотбирать клетки, содержащие плазмидыс селективным маркером,Плазмида рБ 72 - пео придает;устойчивость к неомицину (С 418).Трансформацией клеточных линий293 и АЧ 12 смесью плазмиды рЬРС 167 Г или рЬРС - 1.67 С и вектора, придающего устойчивость к гидромицину,и последующей селекцией гидромицинустойчивых клеток получают большоечисло трансформантовП р и м е р 6. Отбор трансформантов с высокой секрецией.Устойчивые к гидромиц.ну трансформанты, полученные в примере 5, выращивают в 100 мм дисках для тканевыхкультур или плотности в несколькосот клеточных клонов на диск. Средудекантируют и клетки дважды промывают;Нитроцеллюлозные фильтры помещаютв слой агара, после удаления пузырьков. воздуха пластинки инкубируют 13 ч при 37 С, затем помещают в РВБ(50 мИ трис-НС 1, рН 7,2 и 150 мИИаС 1).Для поддержания жизнеспособностиклеток в ходе анализа фильтров клетки покрывают сверху смесью, содер"жащей 2 мл 1,8% агара (47 С), 2 млЭИЕ-солей (37 С) и 4 мл ЭИЕ-солейс 203 телячьей сыворотки (37 С) иопомещают в инкубатор при 37 С. Все промывки и реакции проводятс фильтром, помещенным на качакщуюсяплатформу. Сначала фильтры блокируютинкубированием при комнатной темпе 5 - ССС САС ТСА ССТС ААА с образованием Фага И 13 шр 18-НЕ 5, лигирование Фрагмента БвС 1 " Ба 1 1размером 0,7 кв Фага И 13 шр 18 НЕ 2 с ратуре в 5 Е-ном молоке в РВБ. Затемфильтры промывают 4 раза в РВБ (5 минна промывку). К фильтру прибавляют10 мкг/мл биотинилированных поликлональных овечьих антител против чело-веческого белка С в 2,57.-ном бычьемсывороточном альбумине и инкубируют1 ч при 37 С,фильтры 4 раза промывают РВБ при4 С. Затем авидин Р и биотинилированоную пероксидазу из ложечницы приморской подготавливают и добавляют так,как описано в инструкции поставщика.5фильтры инкубируют с НКР-конъюгироованным авидином Р 1 ч при 4 С (еслисекретировано небольшое количествобелка, то можно использовать болеедлительные инкубационные времена,2 р т.е. ночь).Для проявления цвета индикатораприбавляют НОи инкубируют прикомнатной температуре до проявленияцвета. Колонии, секретирующие наибольшее количество зимогена С человека, отмечаются на фильтрах не только более ранним появлением цвета, нои более темными пятнами на фильтрах.После проявления фильтров их сно-ва накладывают на первоначальныепластинки для соотнесения колоний спятнами на фильтре. Колонии, секретирующие наибольшее количество зимогена С человека, отбирают и используют для получения зимогена,формула изо бре тения Способ конструирования рекомбинантной плаэмцдной ДНК, кодирующей 40 зимоген С человека, .заключающийся втом, что осуществляют выделение фрагмента 0,7 кв плаэмиды рНС 7, лигирование его с Фрагментом БзТ 1 в Ба 1: 1фага МВ шр 18 с образованием М 13 4 шр 18 НЕ 1. проведение саит-специфического мутагенеэа с использованиемолигонуклеотида ЙсоК 1 - БвС 1 фрагментом плаэмидырЬАРС и ЕсоК 1- Ба 1 1 фрагментомразмером 2,0 кв той же плазмиды или1739854 37 МН ИК Н 1 Н 1 С.М СУБ Н 5 РКО ЛЬЛ ЧЛЬ ЬУБ ГНЕ РКО СУБ СЬУ ЛВО РВО ТКР ЬУБ ЛКС ИЕТ СИ 1.УБ ЬУЯ ЛКО БЕК Н 15 ЬЕИ ЬУБ ЛКС ЛБР ТНВ С,0 ЛБР СЬМ С 1 Я ЛБР СЬМ ЧЛЬ В 1 К 2 АВС 1.Е 0 1 ЬГ Ка СЬУ ЬУБ ИЕТ ТНВ ЛВС ЛКО СЬУ ЛБР БЕВ РКО ТВР СЬМ ЧАЬ ЧЛЬ 1,ЕЦ ЬЕ 11 ЛБР ЯЕВ ЬУБ ЬУБ ЬУБ ЬЕ 0 АЬЛ СУБ СЬУ ЛЬЛ ЧА 1 ЬЕ 0 11,Е Н 15 РВО БЕВ ТКРЧЛЬ ЬЕ 11 ТНК ЛЬЛ ЛЬЛ Н 15 СУБ МЕТ АБР СЫ БЕК ЬУБ 1 УБ ЬЕО ЬЕ 11 ЧЛ 1. ЛВО ЬЕ 11 С 1 У СЬО ТУВ ЛБР ЬЕ 11 ЛВС ЛВС ТВР СЫ ЬУБ ТКР СЬЦ ЬЕ 11 Л 5 Р ЬЕ 11 ЛБР 1 ЬЕ ЬУБ СЫ ЧЛЬ Р 11 Е ЧЛЬ Н 15 РВО АЯМ ТУВ БЕВ 1 ЛБ 5 ЕК .ТНК ТНВ ЛБР АЯМ ЛБР 1 ЬЕ ЛЬА ЬЕ 0 ЬЕО Н 15 ЬЕ 11 ЛЬА СЬМ РВО ЛЬЛ ТНВ ЬЕО ЯЕВ СЬМ ТНВ 1 ЬЕ ЧАЬ РКО 1 ЬЕ СУБ .ЬЕ 11 РКО АЯР ЯЕК СЬУ ЬЕц ЛЬА СЫ, АВС СЬЦ ЬЕО ЛБМ СЬМ АЬА СЬУ, СЬМ ОЬЦТНВ ЬЕО ЧАЬ ТНВ СЬУ ТВР СЬУ ТУВ Н 15 БЕК БЕК ЛВО ОЬЦ ЬУБ СЬО АЬА ЬУЯ АВС АБМ ЛКО ТНВ РНЕ ЧЛЬ ЬЕ 0 ЛБМ РНЕ 1 ЬЕ ЬУБ 1 ЬЕ РВО ЧАЬ ЧАЬ РВО Н 18 АБМ СЫ СУЯ БЕВ ОЫ ЧАЬ ИЕТ БЕВ АБМ ИЕТ ЧАЬ БЕВ СЬО ЛБМ НЕТ ЬЕЦ СУЯ АЬА СЬУ 1 ЬЕ ЬЕО СЬУ Л 5 Р ЛКС, ОЬМ ЛБР ЛЬА СУБ ОЬЦ ОЬУ АБР ЯЕВ СЬУ СЬУ РВО ИЕТ ЧАЬ АЬЛ БЕВ РНЕ Н 15 ОЬУ ТНК ТВР РНЕ ЬЕО БЕВ ТВР СЬУ СЬ 0 ОЬУ СХЗ СЬУ ЬЕ 11 ЬЕО Н 15 АЗМ ТУВ ЧАЬ СЬУ ЬЕ 11 ЧЛ 1. ОЬУ ЧАЬ1 ЬЕ АВС ТУВ ТНВ ЬУБ ЧАЬ ЗЕВ ЛКС ТУВ ЬЕО АБР ТВР 1 ЬЕ Н 18 СЬУ Н 18 ЛЯР ЬУЗ СЬц ЛЬЛ РВО СЬМ ЬУЗ ЗЕВ ТВР ЛЬА РВО-СООН В, В, ССС СТС Атт К, ССС АЛО ЛТС ЛСС ЛСС СОО ОСА САС АСС ССС ТСО СЛС СТО СТС СТС СТО СЛС ТСЛ ЛЛС АЛО ЛЛО СТС ССС ТОС ССО ССЛ ,СТС СТС ЛТС СЛС ССС ТСС ТСС СТС СТС ЛСЛ ССО ССС СЛС ТОС ЛТО СЛТ САС ТСС ЛЛС ЛЛС СТС СТТ СТС ЛОО СТТ ОСЛ СЛС ТЛТ СЛС СТО ССО ССС .ТСС ОЛО АЛО ТСС ОЛО СТС СЛС СТО СЛС АТС ЛЛС ОЛС СТС ТТС ОТС СЛС ССС АЛС ТАС АСС ЛЛС ЛСС АСС ЛСС СЛС ЛЛТ ОЛС ЛТС ОСА СТО СТО САС 5.- ОАС ЛСЛ СЛА СЛС СЛАСАА САС СЛА СТА СТО ССС СЛО ССС ОСС ЛСС СТС ТСС СЛО ЛСС АТЛ СТС ССС АТС ТСС СТС ССС СЛС АСС ССС СТТ ССЛ СЛС СОС СЛС СТС ЛЛТ САС ССС ССС САС СЛС тех же фрагментов фага М 13 шрНЕ 4 иплазмиды р 1 АРС, или М 13 врНЕ 5 иплазмиды РЬАРС или рЬРС - 167 Р соответственно с последующим отборомплазмид, кодирующих полипептид, включающий сигнальный пептид и пропептид 38-карбоксилированного секретируемого белка, легкую цепь белка С человека, дине птид лизин-аргинин, аргинин-лизин или аргинин-аргинин со следующей; аминокислотной и нуклеотидной последовательностью;17398541 ОО 110 120 13 О 140ОСС САС САО ОТО СТС ССО АТС СОС ААА СОТ ОСС ААС ТСС ТТС СТО ОАОАЬА Н 1 Б СЬМ ЧАЬ 1.ЕП АВС 1 ЬЕ АВС ЬУБ АВС АЬА АЗМ БЕВ РНЕ ЬЕО ОЬЦ35 40 45150 160 170 180 190 САС СТС СОТ САС АСС АСС СТО САС ССС САО ТОС АТА САС САС АТС ТОТ ОЫ ЬЕО АЙС Н 1 Б ЗЕВ ЯЕВ ЬЕЦ СЖ АЙС СЫ СУБ 1 ЬЕ СЫ ОЫ 1 ЬЕ СУБ50 55 60200 210 220 230 240 САС ТТС САС САО ССС ААС САА АТТ ТТС СЛА ААТ СТО САТ САС АСА СТО АБР РНЕ СЬБ ОЖ АЬАЬУЗ СЫ 1 ЬЕ РНЕ СЬИ АБИ ЧЛЬ АБР АБР ТНВ ЬЕО 65 70 . 75 802502 бо270 280ССС ТТС ТОС ТСС ААС САС СТС.САС СОТ САС САО ТСС ТТС СТС ТТС ССС АЬА РНЕ ТВР БЕВ ЬУБ Н 1 Б ЧАЪ, АБР СЬУ АЗР ОЬИ СХЯ ЬЕ 11 ЧАЬ ЬЕц РКО85 90 95290 300 310 320 330 ТТС ОАО САС ССО ТОС, ССС АСС СТО ТОС ТСС ССС САС СОС АСС ТСС АТС ЬЕЦ ОЬ 11 Н 1 Б РВО СУЯ АЬА ЗЕВ ЬЕО СУБ СУБ СЬУ Н 1 З ОЬУ ТНВ СУБ 1 ЬЕ100 105 110340 350 Збо 370 380ОАС СОС АТС СОС АСС ТТС АСС ТОС САС ТСС СОС АСС ССС ТОО ОАС ОССЛЯР СЬУ 1 ЬЕ 6 ЬУ БЕВ РНЕ ЗЕВ СУБ АЯР СУБ АВО БЕК ОЬУ ТВР СЫ СЬУ115 120 125390 400 410 420 430 ССС ТТС ТСС САС СОС САО ОТО АСС ТТС СТС ААТ ТОС ТСС СТО ОАС ААС АВО РНЕ СУЗ СЬМ АВС ОЫ ЧАЬ ЯЕВ РНЕ ЬЕП АБМ СУБ ЗЕВ ЬЕ 0 АБР АБМ130 135 140440 450 4 бо ., 470 480 ССС ССС ТОС АСС САТ ТАС ТСС СТА САО САС СТС ООС ТСО СОС ССС ТОТ СЬУ СЬУ СУБ ТНВ Н 1 Б ТУВ СУБ ЬЕ 11 СЫ СЬЦ ЧАЬ ОЬУ ТВР АВОАВС СУБ 145 150 155 160490 500 510 . 520АСС ТОТ ССС ССТ ССС ТАС ААС СТО ООС САС ОАС СТС СТО САС ТОТ САС БЕВ СУБ АЬА .РВО СЬУ ТУВ ЬУЯ ЬЕ 0 СЬУ АЯР АБР ЬЕ 0 ЬЕ 0 СЬМ СУЗ Н 1 Б165 170 175530 540 550 5 бо 570ССС ОСА СТО ААС ТТС ССТ ТОТ ССС АСС ССС ТОС ААО ССО АТС САС ААС РВО АЬА ЧАЬ ЬУБ РНЕ РВО СУБ ОЬУ АВС РВО ТВР ЬУЯ АВ 6 МЕТ СЬУ ЬУБ180 185 190580 590 боо б 10 б 20ААС ССС АСТ САС СТО ААА ССА САС ЛСА САА. ОАС САА. ОАА САС САА ОТЛЬУЗ АВС БЕВ Н 1 Б ЬЕ 0 ЬУБ АВС АБР ТНВ СЬО АЯР СЬМ СЫ АБР СЬИ ЧАЬ195 200 205б 30 640 650 ббо б 70САТ ССС ССС СТС АТТ САТ ССО ААС АТС АСС АСС ССО СОА САС АСС СССАБР РВО АВС ЬЕ 0 1 ЬЕ АБР ОЬУ ЬУБ МЕТ ТНВ АВС АВС СЬУ АБР ЗЕВ РЙО210 215 22040 1739854 АСС СТС ОТО АСО ООС ТОО ООС ТС СЛС АОС АСС СОЛ ОЛС ЛЛО ОЛО ОСС ААО АОЛ АЛС СОС АСС ТТС ОТС СТС АЛС ТТС ЛТС ЛЛО АТ 1 ССС ОТООТС ССО СЛС ЛЛТ ОЛО ТОС ЛОС ОЛО ОТС ЛТО ЛОС ЛЛС ЛТО ОТО ТСТ СЛО ЛЛС АТО СТО ТОТ ОСО СОС ЛТС СТС СОО ОЛС ССО СЛС СЛТ ССС ТСС: СЛО ООС ОАС АОТ ООО ООО ССС АТО ОТС ОСС ТСС ТТС СЛС ОСС АСС ТОО ТТС СТООТО ООС:Сто ОТО АОС ТОС ООТ ОАО СОС ТОТ ОСО СТС СИ САС ААС ТА 1ООС ОТТ ТЛС АСС ААЛ ОТС ЛОС СОС ТАС СТС ОЛС ТОО АТС САТ ООО САСАТС АОЛ ОЛС ААО ОЛЛ ОСС ССС САО ААО АОС.ТОО ОСА ССТ"Ъ 1 Составитель Т.ЗабойкинаТехред Л.Олийнык Корректор Л.Патай Редактор Н.Тупица Заказ 2013 Тираж ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская .наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,1011739854 680 690 700 710 720 ТОО САО ОТО ОТС СТО СТО ОАС ТСА ААО ААО ААО СТО ОСС ТОС ООО ОСА ТВР ОЬМ ЧАЬ ЧАЬ ЬЕЦ ЬЕц АБР БЕВ Ь 1 Б ЬУБ ЬУБ ЬЕц АЬА СУЯ ОЬУ АЬА 225 230 235 240 740 ССС ТСС ТОО ОТО РВО БЕВ ТВР ЧАЬ 245780 790 ААО СТС СТТ ОТС АОО ЬУЯ ЬЕ 11 ЬЕН ЧАЬ АВО 260 730 ОТО СТС АТС САС ЧАЬ ЬЕ 11 1 ЬЕ Н 1 Я770 ОАО ТСС ААО ОЫ ЯЕК ЬУЯ 820830 840 850860ТОО ОАО ААО ТОО ОЛО СТО ОАС СТО ОЛС АТС ААО ОАО ОТС ТТС ОТС САСТВР ОЬО ЬУЯ ТВР ОЫ ЬЕН АБР ЬЕЫ АБР 1 ЬЕ ЬУБ ОЫ ЧАЬ РНЕ ЧА 1. Н 1 Б275 280 285 870 880 890 . 900910 ССС ААС ТАС АОС ААО АОС ЛСС АСС ОАС ААТ ОАС АТС ОСА СТО СТО САС РВО АБМ ТУВ ЯЕК ЬХЯ БЕК ТНВ ТНВ АЯР АЗМ АЯР 1 ЬЕ АЬА ЬЕН ЬЕ 11 Н 1 Я290 295 300 920 . 930 940950 960 СТО ОСС САО ССС ОСС АСС СТС ТСО СЛО АСС ЛТА ОТО ССС ЛТС ТОС СТС ЬЕБ АЬА ОЬМ РВО АЬА ТНК ЬЕО ЯЕВ .ОЬМ ТНВ 1 ЬЕ ЧАЬ РКО 1 ЬЕ СУБ ЬЕН 305 310 315 320 970 980 990 1000 ССО ОАС АСС ООС СТТ ОСА ОАО СОС ОАО СТС, ААТ САО ОСС ООС САО ОАО. РВО АБР БЕЙ ОЬУ ЬЕО АЬА ОЬц АВО ОЬН ЬЕН АЯМ ОЬМ АЬА ОЬУ ОЬМ ОЬН325 330 335 1010 1020 1030 , 1040 1050АСС СТС ОТО АСО ООС ТОО ООС ТАС СЛС АОС АОС СОА ОАО ААО ОАО ОССТНК ЬЕО ЧАЬ ТНК ОЬУ ТВР ОЬУ ТУК Н 1 Б ЯЕВ ЗЕВ АВО ОЬЦ ЬУЯ ОЬН АЬА .340 345 350 10601070 1080 1090 1100 ААО АОА ААС СОС АСС ТТС ОТС СТС ААС ТТС АТС ЛАО АТТ ССС ОТО ОТС ЬУБ АВО АБМ АВО ТНК РНЕ ЧАЬ ЬЕЦ АБМ РНЕ 1 ЬЕ ЬУЗ 1 ЬЕ РВО ЧАЪ. ЧАЬ355 360 365 1110 1120 1130 1140 1150 ССО. САС ААТ ОАО ТОС АОС ОАО ОТС АТО АОС ААС АТО ОТО ТСТ ОАО ААС РВО Н 1 Б АБМ СЬО СУБ БЕК ОЮ ЧЛЬ МЕТ БЕК АБМ ИЕТ ЧАЬ БЕВ ОЫ АЗЙ370 375 380 1170 1180 1190 1200АТС СТС ООО ОАС СОО САО ОАТ ОСС ТОС ОАО ООС1 ЬЕ ЬЕО ОЬУ АЗР АКО ОЬМ АЗР АЬА СУЗ ОЬН ОЬУ390. 395 4001220 1230 1240АТО ОТС ОСС ТСС ТТС САС ООС АСС ТОО ТТС СТОИЕТ ЧАЬ АЬА ЯЕВ РНЕ Н 1 Б ОЬУ ТНВ ТВР РНЕ ЬЕН410 415 1260 1270 ОТО АОС ТОО ООТ ОАОООС ТОТ ЧАЬ БЕВ ТКР ОЬУ ОЬН О 1.Х СУЯ 420 425 1250 ОТО ООС СТО ЧАЬ ОЬУ ЬЕ 11 12801290 ООО СТС СТТ САС ААС ТАС ОЬУ ЬЕН ЬЕ 11 Н 1 З АЗМ ТУВ.430 1300 1310 1320 1330 1340ООС ОТТ ТАС АСС ААА ОТС АОС СОС ТАС СТС ОАС ТОО АТССАТ ООО САСОЬУ ЧАЬ ТУВ ТНК ЬУЯ ЧАЬ ЗЕВ АВО ТУК ЬЕН АЗР ТВР 11,Е Н 1 Я ОЬУ Н 18435 440 445 1350 1360 . 1370 1380АТС АОА ОАС ААО ОАА ОСС ССС САО ААО АОС ТОО ОСА ССТ ТАО"31 ЬЕ АВО АЯР ЬУЯ ОЬН АЬА РКО ОЬМ ЬУЗ ЯЕВ ТВР А 1.А РВО-СООН450 455 460 1160АТО СТО ТОТ ОСО ООСИЕТ ЬЕО СУБ АЬА ОЬУ3851210ОАС АОТ ООО ООО СССАЗР ЗЕВ ОЬУ ОЬХ РВО405 750СТО АСА ОСО ОССЬЕЦ ТНВ АЬА АЬА250800СТТ ООЛ ОАО ТАТ ОАСЬЕц ОЬУ ОЬЦ ТУК АЯР265:Ф. 760САС ТОС АТО ОАТН 1 Б С 1 Я ИЕТ АБР255810СТО СОО СОСЬЕН АКО АВО2709854 8и5 -ССА ССС ТСС СТС САС ССС ТСС ССТ ТТТ ССА ТСС .САА ТСС САА ТСС АТС ССА САТ ТАА АСС САС АТС ТАА САА ССА САС ССС ССС ССС ССС ССС ССС ССС ССС ССА С-З)соответственно на концах 5 - и 5 - нити, кодирующей последовательности для выделившегося человеческого белка С. В силу комплементарной природы .пар оснований ДНК, последовательность одной нити двунитевой молекулы ДНК остаточна для определения последовательности второй нити. Плаэмиду рНС 7 выделяют из Е.со 13. К 12 КК 7/рНС 7, депонированного под номером ИККЬ В.Белок С можно представить схематически следующим образом; 1 42 43 197 198 199 200 211 212 461 рге-рго ЬС КК АР АНС .--- нс рге-рго -последовательность аминокислотных остатков 1-42, кодирующая сигнальный пептнд и пропептид белка С че" ловека, важный для направленной секреции и -карбоксилирования белка С.последовательность аминокислотных остатков 43-197 белка С составляет легкую 35 цепь (ЬС) как двуцепочечного зимогена (образованного иэ одноцепочечного зимогена отщеплением КК- дипептида), так и активи рованных форм белка С;последовательность аминокислотных остатков 198- 199 белка С человека; считается, что эти остатки от щепляются возможно в две стадии, включающие в себя сначала расщепление (по остаткам 197 - 198 или 199- 200), а затем действие карбоксипептидазы или аминопептидазы с образованием двуцепочечного белка С;последовательность аминокислотных остатков 200 - Б 211 белка С, включающая в себя пептид активации, отщепляемый от зимогенных 7 173ДНК-последовательность получена иэ к-ДНК-клонов, созданных из человеческой печеночной м-РНК, кодирующей человеческий белок С. Два из этих к-ДНК-клонов используют для конструи" рования ДНК-молекулы, включающей в себя как последовательность, кодирую" щую белок С, так и части ДНК, кодирующие нетранслированную м-РНК на концах 5- и 3-кодирующего участка. Эту молекулу ДНК вводят в Рэс 1-сайт плазмиды рВК 322 для конструирования плазмиды рНС 7. Плазмида рНС 7 включает описанную выше кодирующую последовательность, а также следующие дополнительные последовательности:5 -С ТСС АСС ССС ССС ССС ССС СССССС СТА ТСА ТСС ССС САС ССС СААСТТ ССА СТА ТСТ ССА ССА ССС СССССТ АСА ССТ ССС АСТ ССС ТСС АСАформ С с образованием активированного белка С;АНС - последовательность аминокислотных остатков 212 -461 белка. С, однократнопост-трансляционно модифицированного, составляет активированную тяжелую цепь(АНС) активного белка С;НС - тяжелая цепь двуцепочечнойформы эимогена С, однократ"но пост-трансляционно модифицированного, состоитиз аминокислотных остатков200 - 461,.АР и АНС.Зимоген С является предшественником сариновой протеаэы, синтезируемым в печени и присутствующим в крови, . Для проявления полной биологической активности белок С требует посттрансляционных модификаций, для которых необходим витамин К. Двуцепочечный, связанный дисульфидным мостиком, зимоген С образуется из одноцепочечного эимогена протеолизом. Считается, что этот ограниченный протеолиэ включает в себя отщепление и удаление аминокислотных остатков 198 и 199. Активация двуцепочечного зимогена включает в себя протеолитическое расщепление пептидной связи . АКС-ЬК 0 (остатки 211 и 212). Это последнее расщепление освобождает де173985 9 1 О 15 Таблица 1 Однобуквенное сокращение Фенилаланин РНЕ ЬЕП Лейцин ИэолейцинМетионинВалинСерииПролинТреонинАланинТирозинГистидинГлут аминАспарагинЛизин 1 ЬЕ РКО 35 АЬА Н Н 1 Б 40 ЬУ 8 АЗР Аспарагнноваякислота . Глутаминоваякислота С 1 Б ЦистеинТриптофанАргининГлицин 50 55 капептид (остатки 200 - 211), активационный пептид, составляющий аминоокончание большей (тяжелой) цепи дву" цепочечной молекулы знмогена. Белок С содержит около 237 углеводов. Белок С содержит также большое количество необычных аминокислот, включая-карбоксиглутаминовую кислоту и -оксиаспарагиновую кислоту,11-карбоксиглутаминовая кислота (Б 1 а) образуется -глутамилкарбоксилированием из остатков глутаминовой кислоты с помощью микросомальной карбоксилазы.Аминокислотные остатки в описываемых белках и пептидах имеют сокращения, приведенные в табл.1. Трехбук- Аминокислотныйвенное остатоксокращение 4 10Описано несколько способов получения нативного эимогена человеческого белка С. Зимогенная форма человеческого белка С, полученная техно-,логиеи рекомбинантной ДНК, идентичнаэимогенным формам человеческого белкаС; естественно присутствующим в человеческой крови, и активируется в телелишь естественным путем, включающимтромбин-тромбомодулиновый комплексВ данном изобретении предлагаютсязимогенные формы человеческого белкаС, которые могут активироватьсяп дчо одним тромбином с клиническизначительной скоростью. Кроме. того,зти эимогенные формы легче подвергаются активации тромбин/бромбомодулином, чем нативный зимоген человеческого белка С.В изобретении предлагаются такжерекомбинантные ДНК, которые кодируютпре-препептид, содержащий сигнальныйпептид для направления секреции ипропептид из -карбоксилированногобелка,Рекомбннантные ДНК по. данномуизобретению включает в себя такжепоследовательность, кодирующую легкуюцепь человеческого белка С, расположенную в трансляционной структуресчитывания сразу за последовательностью, кодирующей пре-пропентид.: Легкая цепь человеческого белка Ссодержитаминокислотные последовательности 43-197 белка С. Аминоконцевые части витамин К-зависимых плазменных белков, такие как аминоконцевая часть легкой цепи белка С, ответственны за связывающую кальций активность этих белков.Рекомбинантные ДНК по данномуизобретению включают в себя такжепоследовательность, кодирующую дипептид ЬСБ-АКС (КК), расположенный в5 трансляционной структуре считываниясразу эа последовательностью, кодирующей легкую цепь, Дипептид ЬУБ-АКСрасположен на карбокси-концевомучастке легкой цепи.Зимогенные формы.по данному изобретению отличаются от.нативных зимогенных форм человеческого белка С,В нативном человеческом белке С,имеется следующий активационный пеп-.тид 11739854 12 10 15 ЬЕО ТНВ БЕВ ЬЕО 1.ЕО ЬЕО РНЕ ЧАЬ АЬА ТНВ ТВР СЬУ 1 ЬЕ НР-ИЕТ ТВР СЬМБЕВ СЬУ ТНВ РВО АЬА РВО ЬЕО АБР БЕВ ЧАЬ РНЕ ЯЕВ БЕВ -БЕВ СЬО АВС АЬА Н 1 Б СЬМ ЧАЬ ЬЕО АВС 1 ЬЕ АВС ЬУБ АВС АЬА АБМ БЕВ РНЕ ЬЕО СЬО ОЬО,ЬЕО АКС Н 13 БЕВ ЯЕВ ЬЕО СЬО АВС СЬО СУБ 1 ЬЕ СЬО СЬО 1 ЬЕ СУБ АБР РНЕ СЬО СЬО АЬА ЬУБ СЬО 1 ЬЕ РНЕ СЬМ АБМ ЧАЬ АБР АЯР ТНВ ЬЕО АЬА РНЕ ТВР БЕК ЬУБ Н 13 ЧАЬ АБР СЬУ АЯР СЬМ СУБ ЬЕО ЧАЬ ЬЕО РКО РВО СУБ АЬА ЗЕВ ЬЕО СУБ СХБ ОЬУ Н 18 СЬХ ТНВ СУБ 1 ЬЕ ЬЕО СЬО Н 13 АБР СЬУ 1 ЬЕ АВО РНЕ СУБ СЬУ БЕВ РНЕ БЕВ СУБ АБР СУБ АВС БЕВ ОЬУ ТВР СЬО СЬУ ОЬМ АКС ОЬО ЧАЬ БЕВ РНЕ ЬЕО АЗМ СУЯ ЗЕВ ЬЕО АБР АЗМ ТНВ Н 18 ТУВ СУЯ ЬЕО СЬО ОЬО ЧАЬ ОЬУ ТКР АВО АВО СУБ СЬУ ОЬУ СУЯ БЕВ СУБ АЬА РВО АЬА ЧАЬ 1.УБ АВС ЗЕВ РВО ОЬУ ТУВ ЬУЗ ЬЕО СЬУАЗР АЗР ЬЕО ЬЕО СЬМ СУЗ Н 18 ЬУБ РНЕ РВО СУБ ОЬУ АВО РВО ТВР ЬУБ АВО НЕТ ОЬО ЬУБ Н 18 ЬЕО ЬУБ АВС АБР ТНВ ОЬО АЗР 6 ЬМ ОЬО АБР ОЬМ ЧАЬ В К 2 АВС ЬЕО 1 ЬЕ Вз ОЬУ ЬУЗ ИЕТ ТНК АВС АКС ОЬУ АЗР БЕВ РВО ТКР ОЬМ ЧАЬ ЧАЬ ЬЕО ЬЕО АБР ЗЕК ЬУБ ЬУБ ЬУБ ЬЕО АЬА СУБ СЬУ АЬА ЧАЬ ЬЕО 1 ЬЕ Н 18 РКО БЕК ТВР ЧАЬ ЬЕО ТНК АЬА АЬА Н 13 СУЗ ИЕТ АБР СЬО ЗЕВ ЬУБ ЬУЗ ЬЕО ЬЕО ЧАЬ АВО ЬЕО ОЬУ СЬО ТУК АЗР ЬЕО АВС АВС ТВР ОЬО ЬУЗ ТВР ОЬО ЬЕО АБР ЬЕО АБР 1 ЬЕ ЬУБ ОЬО ЧАЬ РНЕ ЧАЬ Н 18 где числа соответствуют положению аминокислотных остатков в белке С. В данном изобретении описывается замена остатка АЯР в положении 209 на один из следующих остатков: РИЕ, СЬУ, ТУВ или ТВР, что приводит к соответствующей зимогенной форме, имеющей большую чувствительность к расщеплению одним тромбином, кроме повышенной чувствительности к расщеплению тром-; бин-тромбомодулиновым комплексом.Другие замены аминокислот наряду с заменами в положении 209 могут также повышать чувствительность результирующего зимогена к действию тромбина, Выражение результирующий зимоген" означает, что хотя замены описаны с указанием положения аминокислотных остатков в выделившемся человеческом белке С однако выделившийся человеческий белок С должен быть сначала секретирован (что приводит к отщеплению аминокислотныхостатков 1 - 42) с образованием зимогенной формы. Замена пролиновогоостатка в положении 2 10 в выделившемся человеческом белке С на валин,кроме одной из четырех описанных выше замен в положении 209, приводитк новому зимогену, Замена остаткааспарагиновой кислоты в положении214 белка С, наряду с одной из описанных выше замен в положении 209 ис заменой, описанной для положения210, или без такой замены, на остаток аспарагина также приводит к получению нового зимогена,Таким образом, предпочтительныеновые зимогенные формы человеческогобелка С образуются в результате секреции и обработки молекул вЫцелившегося человеческого белка С со сле-,дующей аминокислотной последовательностью:13 1739854 14 РВО АБМ ТУВ БЕВ .ЬУБ БЕВ ТНВ ТНВ АЯР АЯМ АЯР 1 ЬЕ АЬА ЬЕО ЬЕО Н 13ЬЕц АЬА ОЬМ РВО А 1 А ТНВ ЬЕБ БЕВ ОЬМ ТНВ П.Е ЧАЬ РВО 1 ЬЕ СУБ ЬЕЦ РВО АБР БЕК ОСУ ЬЕ 11 АЬА ОЫ АВО ОЫ ЬЕ 11 АЯМ ОЬМ АЬА ОЬЪ ОЬМ ОЖ ТНВ ЬЕ 11 ЧАЬ ТНВ ОЬУ ТКР ОЬУ ТУВ Н 13 ЯЕВ,БЕВ АВО ОЬЦ ИБ ОЬЦ АЬА ЬУЯ АВО АБМ АВО ТНК РНЕ ЧАЬ ЬЕО АЯМ РНЕ 1 ЬЕ ЫЯ 1 ЬЕ РВО ЧА 1, ЧАЬ РКО Н 13 АБМ ОЬц СУБ БЕК ОЬЦ ЧАЬ ИЕТ ЯЕК АЯМ ИЕТ ЧАЬ ЯЕВ ОЫ.АБМ ИЕТ ЬЕИ СТБ АЬА .ОЬУ - 1 ЬЕ ЬЕ 0 ОЬУ АБР АВО ОЬМ АЯР АЬА СУБ ОЫ ОЬУ АБР ЯЕК ОЬУ ОЬУ РЙО .ИЕТ ЧАЬ АЬА БЕВ РНЕ Н 13 ОИ ТНК ТВР РНЕ ЬЕЦ ЧАЬ ОЬУ ЬЕц ЧАЬ. БЕВ ТВР И,У ОЫ ОЬУ СУБ ОЬУ ЬЕЮ ЬЕ 0 Н 13 АБМ ТУВ ОЬУ ЧАЬ ТУК ТНВ ИЯ ЧАЬ БЕВ АВО ТУВ ЬЕЦ АБР ТКР 1 ЬЕ Н 13 ОИ Н 13 1 ЬЕ АВС АБР ЬУБ ОЫ АЬА РВО 6 ЬМ ЬУЯ ЯЕВ ТКР АЬА РКО"СООН,Продолжениетабл. 2 Т Т Эту кодирующую после вставляют в вектор для плазмиды рЬ АРС.Аминокислотные посл кодируемые в положения 214 в предпочтительных последовательностях, и табл.2. овательностьолучения Плазмида рЬРСявляется иллюс тративным вектором экспрессии, в котором кодаи аспарагиновой кислоты в положении 209 белка С заменен на ко.- дон для глнцина. Конструирование плазмиды рЬРСописано в примере 3. Существенно, что конструирование включает в себя сайт-сиецифичный мутагенез последовательности, кодирующей белок СЧасть последовательности, кодирующей белок С, вставляют в в фаг М 13 шр 18 и изменяют сайт-специфичным мутагенезом. Подвергнутую мутагенезу кодирующую последователь.1 ность клонируют затем в эукариотном клонирующем векторе для получения плазмиды рЬРС, идентичной плаз довательнос 209, 210 и кодирующих. едставлены ва б л и ц а дине оложение 209 210 АБР АБМ АБР НЕ НЕ где К является РНЕ, 61 Л, ТУК или ТВР 3 К представляет собой РКО или ЧИ.; КЗ представляет собой АБР нли АБМ.,Кодирующие последовательности мо гут быть легко сконструированы, исходя из последовательности, кодирующей белок:С, из которой сайт-специфическим мутагенезом должен быть удален участок, кодирующий АР. Схематически эту кодирующую последовательность можно представить в виде следующей структуры: 30 35 40 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13, 14 15 .16 РНЕ СЬУ СЬУ ОЬУ СЬУ ТУК ТУК ТУК ТУК ТКР ЧА 1, РКО РЮ ЧЯ. ЧА 1 РКО РЮ ЧАЬ ЧА 1 РЮ РЮ ЧАЬ АЯМ АБР АБМ АЯР АЯМ АБР АБМ АБР АБМ АЯР АБМ АЯР АЯМ15 13 миде р 1 АРС, за исключением того, что имеется вставка последовательности, кодирующей активационный пептид, в, котором кодон для глицина заменен на кодон для аспарагиновой кислоты в положении 209.В случае соединений по предлагаемому способу, где остаток аспарагиновой кислоты в положении 214 заме-. нен на остаток аспарагина, производ" ное белка С, получаемое при активации зимогенной формы, также является соединением по данному изобретению.ДНК по данному изобретению могут быть также синтезированы химически или соединением рестрикционных фрагментов, либо сочетанием способов, известных в данной области.Иллюстративные векторы по данному изобретению, плазмиды рЬРСб 6 и рЕРСбС содержат ВК-усилитель, стимулирующий транскрипцию аденовирусным основным поздним промотором, Большое число эукариотных промоторов, усилителей и векторов экспрессии известно в данной области и может быть использовано в предлагаемом способе. Эукариотный вектор экспрессии может также функционировать без усиливающего элемента. Суть данного изобретения не связана с конкретным усилителем или промотором, используемым для стимуляции экспрессии зимогена белка С, а скорее определяется новой кодирующей последовательностью и соответствующими белками, получаемыми из такой последовательности.Однако выбор векторных элементов таких как промоторы, усилители и селективные маркеры, может оказать сильное влияние на максимальные кон-. центрации белка, вырабатываемого клеткой"хозяином.Выбор клеток-хозяев зависит от конкретного вектора экспрессии, используемого для экспрессии .ДНК-соединений, кодирующих белков С. Поскольку белок С и производные белка С согласно предлагаемому способу подвергаются значительной пост-трансляционной модификации, то некоторые клетки-хозяева более предпочтительны для использования с векторами по данному изобретению, Известно, что трансформированные аденовирусом чело-. веческие эмбриональные почечные клетки предпочтительны для испольэо вания при рекомбинантном получении-карбоксилированных белков, таких3как человеческий белок С. Одна такая трансформирования аденовирусомлиния клеток человеческой эмбриональной почки представляет собой линию клеток 293, доступную в АТСС подномером АТСС СИ, 153.Однако преимущества при получении-карбоксилированного белка, такогокак зимоген человеческого белка С влинии клеток, трансформированных аденовирусом, не ограничиваются чело-,веческими почечными эмбриональнымиклетками, трансформированными аденовирусом, Фактически, как правило,трансформированные аденовирусом клетки являются отличными хозяевами дляполучения -карбоксилированного человеческого белка С, Одной из особенно предпочтительных клеточныхлиний этого типа является АЧ 12-бб 4(далее обозначается как АЧ 12) клеточная линия, доступная в АТСС под 2 номером АТСС СЮ 9595, Клеточная линия АЧ 12,получена инъекцией человеческого аденовируса 12 в шею сирийского хомяка и выделением клеток результирующей опухоли.Экспрессия кодирующих последовательностей человеческого. белка С,содержащихся в векторах по данномуизобретению, происходит в тех клетках-хозяевах, в которых промоторсвязан со структурными генными функ циями.Векторы рБЧ 2-типа включают в себя сегменты генома БЧ 40, содержащего определенный эукариотный промоторединицу ер), последовательность вве" 40 дения (ЧБ) и полиаденомный (рА)сайт, При отсутствии Т-антигена БЧ 40плазмидные векторы рБЧ 2-типа трансформируют клетки-хозяева млекопитающих и другие эукариотные клетки ин тегрированием в хромосомную ДНК клеток-хозяев.Вырожденность генетического кодапозволяет заменить нуклеотиды вучастках, кодирующих полипептид, а О также в трансляционном стоп-сигналебез изменения последовательности,кодирующей полипептид. Такие последовательности могут быть выведены иэ известной аминокислотной или ДНК-.последовательности человеческого белка С и могут быть сконструированы пообычным синтетическим или сайт-специфичным мутагенным методикам.25 Основным недостатком активированного белка С, как и любых активированных сериновых протеаз, является егокороткое время полураспада (Т 1/2) посравнению с зимогенным предшественником. Причиной более короткого биологического полураспада активированныхсериновых протеаз, включая активированный белок С, являются сложные 10процессы, вовлекающие клеточные и.гуморальные механизмы, Активированныесериновые протеазы образуют такжекомплексы с ингибиторами сериновыхпротеаз, в норме присутствующими в 15плазме. Активированный белок С (АРС)комплексуется с АРС-ингибитором, атакже с альфа-макроглобулином. Неактивные зимогены, включая зимогеныбелка С по данному изобретению, не 20реагируют с ингибиторами сериновыхпротеаз.Преимущество предлагаемых зимогенов С заключается в том, что онилучше активируются тромбином, чемзимоген нативного белка, посколькудля активации зимогенов в присутствииСа отсутствует абсолютное требоваФние комплексования тромбина с тромбомодулином. Это означает, что эти З 0зимогены С после введения могут активироваться в местах внутрисосудистого образования тромбина, т,е. в любых зонах развития внутрисосудистыхтромбов, Таким образом эти рекомби-.нантные зимогены белка С могут бытьиспользованы как превентивные ле-,карства и будут при этом активироваться только в местах образованиятромбов. Так как зти чувствительныек тромбину зимогены могут вводиться.46в зимогенной форме, то они не будутобразовывать комплексы с ингибитора"ми белка С и будут обладать биологи-.ческим временем полураспада, равнымтаковому времени для .зимогена нативного белка С.Рекомбинантные зимогены белка С,по данному изобретению пригодны дляпредупреждения и лечения широкогоспектра заболеваний, включая внутри 50сосудистое свертывание, в том числеглубокий тромбоз вен, легочный эмболизм, периферийный артериальныйтромбоз, змболиэм, возникший в сердце и периферийных артериях, острыйинфаркт. миокарда, тромботические .удары и диссеминирующий внутрисосудистый тромбоз,По сравнению с активированным белком С дозы зимогенов белка С по данному изобретению из-за их увеличенного Т 1/2 могут быть значительно снижены при клиническом применении. При гомозиготном дефиците белка С доза зимогена белка С по данному изобретению находится в интервале приблизительно 5 - 100 мг на одно лечение, а при гетерозиготном дефиците белка С - в интервале около 2,5 - 50 мг на лечение.Хорошим терапевтическим показа- кием для активированного белка С является предотвращение глубокого тромбоза вен и легочного эмболизма.Зимогены белка С по данному изобретению могут быть использованы при лечении змболий, происходящих от тромбов в периферийных артериях, преимущественно в каротидных артериях.Зимогены по даннойу изобретению пригодны также для лечения острых инфарктов миокарда. В острой фазе инфаркта миокарда эти зимогены можно вводить вместе с активатором ткане вого плазминогена. П р и м е р 1. Контсруированиеплаэ миды р 1 АРС.,А, Выделение ДНК-. фрагмента, кодирующего пептиц белка С.Плазмида РНС 7 содержит полную кодирукщую последовательность белка С.1 л Ь-бульона (10 г пептона, 10 г МаС 1, 5 г дрожжевого экстракта), содержащего 15 мкг/мл тетрациклина, засевают культурой ЕзсЬегьсМа со 1 К 12 В 3.1/рНС 7, инкубируют со встряхиванием при 37 С до достижения оптиоческой плотности (О.П,) при 590 нм приблизительно 1 и прибавляют 150 мг хлорамфеникола. Инкубирование продолжают 16 ч; добавление хлорамфеникола ингибирует синтез белка и дальнейшее деление клеток, но позволяет плазмидам по-прежнему реплицироваться.Культуру центрифугируют, супернатант отбрасывают, клеточную массу промывают 40 мл ТЕЗ-буфера (10 мМ трис-НС 1,рН 7,5; 10 мМ ЯаС 1 и 1 мМ ЭДТА) и затем снова осаждают центрифугированием. Супернатант отбрасывают, клеточную массу замораживают в бане сухой лед - этанол и затем . оттаивают. Оттаявшую клеточную мас су ресуспендируют в 10 мл раствора

Смотреть

Заявка

4613143, 22.12.1988

Эли Лилли ЭНД Компани

НИЛЬС УЛЬРИК БЭНГ, ХАРМУТ ДЖОЗЕФ ЭРЛИХ, БРАЙАН ВИЛЛЬЯМ ГРИННЕЛЛ, САУ-ЧИ БЕТТИ ЯН

МПК / Метки

МПК: C12N 15/12

Метки: человека, кодирующей, днк, зимоген, конструирования, рекомбинантной, плазмидной

Опубликовано: 07.06.1992

Код ссылки

<a href="http://patents.su/20-1739854-sposob-konstruirovaniya-rekombinantnojj-plazmidnojj-dnk-kodiruyushhejj-zimogen-s-cheloveka.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентов СССР">Способ конструирования рекомбинантной плазмидной днк, кодирующей зимоген с человека</a>

Похожие патенты